KTB1343-CN-糖原磷酸化酶b（GPb）活性检测试剂盒（微量法）

糖原磷酸化酶b（GPb）活性检测试剂盒（微量法）原理糖原磷酸化酶是糖原分解代谢中的关键酶，催化糖原的磷酸化反应。该酶分为有活性的糖原磷酸化酶a（Glycogenphosphorylasea,GPa）和无活性的糖原磷酸化酶b（Glycogenphosphorylaseb,GPb）两种形式。糖原的分解主要在GPa的催化下进行。CheKine™糖原磷酸化酶b（GPb）活性检测试剂盒（微量法）可检测动物组织、细胞或细菌、血清（浆）或其他液体样本。在该试剂盒中，未添加激活剂时，GPa催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化NADP还原生成NADPH，在340nm下测定NADPH上升速率，即可反映GPa活性。添加激活剂测定GP（GPa和GPb）总活性，GP活性-GPa活性得到GPb活性。包装清单试剂盒组分规格储存条件48T96TExtractionBuffer60mL60×2mL4℃ReagentⅠ11.2mL22.4mL4℃，避光保存ReagentIIPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentIIIPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentIVPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentVPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存注意：正式检测前，建议选择2-3个预期差异较大的样本进行预实验。自备耗材·酶标仪或紫外光分光光度计（能测340nm处的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5mL离心管·水浴锅、低温离心机·去离子水·匀浆器或研钵（如果是组织样本）试剂准备ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。WorkingReagent：临用前配制；将ReagentII全部转移至ReagentI中，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。ReagentIII：临用前配制；48T加入0.7mL去离子水，96T加入1.4mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。ReagentIV：临用前配制；48T加入0.7mL去离子水，96T加入1.4mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。ReagentV：临用前配制；48T加入0.35mL去离子水，96T加入0.7mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。样本制备注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4h内完成样品解冻。动物组织：称取约0.1g样本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。细菌和细胞：收集500万细菌或细胞到离心管内，用冷PBS清洗细菌或细胞，离心后弃上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超声波破碎细菌或细胞30次（功率20%或200W，超声3s，间隔7s），然后8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。血清（浆）等液体样本：直接检测。注意：1.如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。该试剂盒提取的样本也可以适用于KTB1342的测定。实验步骤酶标仪或紫外光分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，紫外光分光光度计用去离子水调零。操作表（下述操作在96孔UV板或微量石英比色皿中操作）：试剂测定孔（μL）对照孔（μL）样本1010ReagentIII1010ReagentIV1010去离子水010ReagentV100WorkingReagent160160充分混匀，记录340nm处10s时吸光值A1，37℃反应10min记录610s时的吸光值A2。测定孔记为A测定，对照孔记为A对照。计算，ΔA测定=A2测定-A1测定，ΔA对照=A2对照-A1对照，ΔA=(A2测定-A1测定)-(A2对照-A1对照)。注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验，每个样本均需设置一个对照孔。如果ΔA小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA大于0.6，样本可用ExtractionBuffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。若ΔA出现负值，则说明样本中不含GPb或已降解。结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。GPb活性的计算使用96孔UV板测定的计算公式如下按样本蛋白浓度计算：酶活单位定义：每毫克蛋白每分钟产生1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。总GP(U/mgprot)=[ΔA测定×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=643×ΔA测定÷CprGPa(U/mgprot)=[ΔA对照×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=643×ΔA对照÷CprGPb(U/mgprot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=643×ΔA÷Cpr按样本鲜重计算：酶活单位定义：每克样本每分钟产生1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。总GP(U/g鲜重)=[ΔA测定×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=643×ΔA÷WGPa(U/g鲜重)=[ΔA对照×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=643×ΔA对照÷WGPb(U/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=643×ΔA÷W按细菌或细胞数量计算酶活单位定义：每104细菌或细胞每分钟产生1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。总GP(U/104)=[ΔA测定×V反总÷(ε×d)×109]÷(n×V样÷V样总)÷T=643×ΔA测定÷nGPa(U/104)=[ΔA对照×V反总÷(ε×d)×109]÷(n×V样÷V样总)÷T=643×ΔA对照÷nGPb(U/104)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(n×V样÷V样总)÷T=643×ΔA÷n按样本体积计算酶活单位定义：每毫升液体每分钟产生1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。总GP(U/mL)＝[ΔA测定×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总)÷T=643×ΔA测定GPa(U/mL)＝[ΔA对照×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总)÷T=643×ΔA对照GPb(U/mL)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总)÷T=643×ΔAV反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：96孔UV板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；n：细菌或细胞数量，以万计。使用微量石英比色皿测定的计算公式将上述计算公式中光径d：0.5cm调整为d：1cm进行计算即可。结果展示以下数据仅供参考，实验者需根据自己的实验对样品进行检测。Figure1.本试剂盒测定兔肝脏和肺中GPb的活性。相关产品CatalogNo.Product