KTB9041-CN-过氧化氢（H2O2）含量检测试剂盒（荧光法）

过氧化氢（H2O2）含量检测试剂盒（荧光法）原理过氧化氢（H2O2）含量检测试剂盒（荧光法）可检测动物或植物组织、细胞、血清（浆）或其他液体等样本，其原理是H2O2在酶和荧光物质存在下反应，其在激发波长535nm和发射波长587nm处的荧光强度与H2O2浓度成正比。包装清单试剂盒组分规格储存条件48T96TAssayBuffer75mL75×2mL4℃ReagentⅠ35µL70µL-20℃，避光保存ReagentⅡ14µL28µL-20℃，避光保存SOD30µL60µL-20℃，避光保存Standard(8.8M)100µL100µL-20℃，避光保存注意：正式检测前，建议选择2-3个预期差异较大的样本进行预实验。自备耗材·荧光酶标仪（激发波长为535nm，发射波长为587nm）·全黑96孔板、可调节式移液枪及枪头·低温离心机、恒温箱、制冰机·去离子水，PBS(pH7.0)·匀浆器（如果是组织样本）试剂准备AssayBuffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；用不完的试剂在-20℃避光分装保存，避免反复冻融。注意：ReagentⅠ有毒，建议在通风橱进行实验。ReagentⅡ：即用型；-20℃避光保存。SOD：即用型；-20℃避光保存。WorkingReagent：临用前避光配制；取50μLReagentⅠ和20μLReagentⅡ，加入4.93mLAssayBuffer，充分混匀，该体积可用100次，按需配制，当天内使用，使用时须避光。Standard(8.8M)：使用前，用去离子水稀释1,000倍得到8.8mM标准品，充分溶解待用。用不完的Standard(8.8M)-20℃避光分装保存，避免反复冻融。Standard设置：按下表所示，配制标准品溶液。序号Standard体积AssayBuffer体积（µL）标准品浓度（µM）Std.111.5µL8.8mMStandard988.5100Std.2500µLofStd.1(100μM)50050Std.3500µLofStd.2(50μM)50025Std.4500µLofStd.3(25μM)50012.5Std.5500µLofStd.4(12.5μM)5006.25Std.6500µLofStd.5(6.25μM)5003.125Std.7500µLofStd.6(3.125μM)5001.560（空白孔）05000注意：稀释的标准品溶液现配现用，尽快检测，不宜长久放置。样本制备注意：样本以新鲜为宜，若不能立刻检测，应储存在-80℃保存。1.动植物组织：称取0.1g样本，加入1mL冷的AssayBuffer，冰浴匀浆，10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。2.细胞：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL冷的AssayBuffer，冰浴超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。3.血清或其他液体样本：10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。注意：1.实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本用AssayBuffer稀释成不同浓度进行预实验，根据预试验的结果，结合本试剂盒的线性范围：0.02-10μmol/L，请参考下表稀释（仅供参考），若检测值为负或样品中NADH浓度超过10μM和谷胱甘肽浓度超过50μM时，可向反应体系中添加SOD，每孔0.4μL。样本稀释倍数样本稀释倍数10%小鼠脑1-310%小鼠肺1-3胎牛血清1-210%烟草叶1-2避免使用含有DTT或β-巯基乙醇的样品，因为Resorufin在存在超过10μM硫醇的情况下不稳定。如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。实验步骤1.荧光酶标仪预热30min以上，调节激发波长为535nm，发射波长为587nm。2.操作表（下述操作在全黑96孔板中操作）：试剂测定孔（μL）标准孔（μL）样本500Standard050WorkingReagent5050混匀，室温避光静置20min，荧光酶标仪上设置激发波长535nm，发射波长587nm，测定各孔荧光值，分别记为RFU测定、RFU标准和RFU空白，计算ΔRFU测定=RFU测定-RFU空白，ΔRFU标准=RFU标准-RFU空白。结果计算标准曲线的绘制以标准溶液浓度为x轴，ΔRFU标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔRFU测定带入方程得到x(μM)。H2O2含量的计算：按样本蛋白浓度计算：H2O2(nmol/mgprot)=x×f÷Cpr按样本鲜重计算：H2O2(nmol/g鲜重)=x×f÷W按照细胞数量计算H2O2(nmol/104cell)=x×f÷N按液体体积计算：H2O2(nmol/mL)=x×fCpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；f：样本稀释倍数；W：样品质量，g；N：细胞总数，104。结果展示典型标准曲线：H2O2Standard(μM)ΔΔRFU标准Figure1.H2O2的标准曲线示例：取0.168g小鼠脑加入1mLAssayBuffer进行匀浆研磨，离心取上清稀释3倍之后按照测定步骤操作，用全黑96孔板测得：RFU测定为2,970，RFU空白为502，ΔRFU测定=2,970-502=2,468，标准曲线为y=1,790.1x+542.68，H2O2浓度为1.076µM，H2O2（样本）=1.076×3÷0.168=19.21nmol/g鲜重。取胎牛血清离心取上清直接按照测定步骤操作，用全黑96孔板测得：RFU测定为1,172，RFU空白为502，ΔRFU测定=1,172-502=670，标准曲线为y=1790.1x+542.68，H2O2浓度为0.071µM，H2O2（样本）=0.071nmol/mL。相关产品 CatalogNo.ProductNameKTB9050CheKine™Pro丙二醛（MDA