出口化妆品中病原菌检测方法 微滴式数字PCR法 第4部分：肺炎克雷伯氏菌

1进出口化妆品中病原菌检测方法微滴式数字PCR法第4部分：肺炎克雷伯氏菌本文件描述了进出口化妆品中肺炎克雷伯氏菌的微滴式数字PCR检测方法。本文件适用于进出口化妆品中肺炎克雷伯氏菌的快速检测。本文件所能达到的检出限(LOD₀)为0.27CFU/g(mL)-0.47CFU/g(mL)。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件，不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T2206.3化妆品微生物检验方法第3部分：肺炎克雷伯氏菌SN/T5075化妆品微生物检验制样规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸(DeoyribonuleicAcid)ddPCR:微滴式数字PCR(dropletdigitalPolymenseChainReaction)PCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)5方法原理针对肺炎克雷伯氏菌phoE基因设计引物、探针，将一定浓度的引物、探针与模板DNA及反应预混液混合，配成PCR反应体系。将该数字PCR体系分布到12000个~20000个微滴中，使大部分微记BHQ1。利用数字PCR系统的检测通道，可对每个微滴的荧光信号进行采集分析。含有模板DNA的微滴出现荧光信号的增强，形成阳性微滴簇。最终根据阳性微滴的有无判定样品中是否含有肺炎克2Primer-R:5'-CCACCGCTTCAAACTTC吸取10mL1:10样品稀释液接种到90mLSCDLP增菌液中，置于36℃±1℃培养箱培养混匀增菌培养物，在其液面表层吸取1mL,于时，用生理盐水清洗沉淀1次~2次。用1mL生理盐水混悬沉淀，于10000g~12000g离心3min,弃去上清液。在沉淀中加人50μLDNA提取液振荡混匀，于95℃~100℃加热10min,室温冷却按照公式(1)计算DNA的浓度。4A—260mm处的吸光值；N—核酸稀释倍数。A/4m在1.8-2.0之间，DNA浓度为0.01ng/μL-10ng/pL时。适用ddPCR检测。检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照和空白对照。以肺炎克雷伯氏菌标准菌株DNA或含目的片段的DNA作为阳性对照，以非肺炎克雷伯氏菌标准菌株DNA作为阴性对照，用等体积的一级水代替模板DNA作为空白对照。每个待检样品提取的DNA溶液进行3个平行ddPCR检测。按照表1配制反应体系。一一水一一将配制好的ddPCR反应混合液，加人微滴生成装置加样孔中，按仪器操作说明生成微滴。将生成的微滴缓慢转移至96孔板中，封膜后置于PCR仪上，按以下参数进行PCR扩增：95℃10min;94℃30s,57℃1min,40个循环；98C10min,12℃10min。升降温速度设置为≤扩增反应结束后，将96孔板放入ddPCR检测仪中对每个微滴进行荧光检测，采用FAM通道读6主要培养基和试剂A.1DNA提取液灭菌一级水将Chelex-100颗粒加入灭菌一级水中混匀，2℃-8℃保存。A2大豆酪蛋白卵磷脂吐温80(SCDLP)液体培养基A.2.1成分酪蛋白胨大豆蛋白胨氯化钠磷酸氢二钾葡萄糖卵磷脂蒸馏水先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其他成分混合，加热溶解，调pH值为7.2-7.3,分装，每瓶90mL,121℃