山东省艾滋病检测实验室操作规范(白)

艾滋病检测实验室操作标准济宁市疾病预防控制中心白传记1目录一.管理依据二.制定相应规章制度、平安守那么、SOP三.实验室检测要求〔检测样本的管理、检测方法、试剂、结果的判读、报告、质量控制2一、管理依据3实验室分级1、艾滋病参比实验室2、艾滋病检测确证实验室〔1〕艾滋病确证中心实验室〔2〕艾滋病确证实验室3、艾滋病检测筛查实验室

〔1〕艾滋病筛查中心实验室

〔2〕艾滋病筛查实验室〔3〕艾滋病检测点——见?全国艾滋病检测工作管理方法?4艾滋病筛查实验室职能5艾滋病病人确实诊需要三级实验室完成因为艾滋病是一种不能彻底治愈的传染病，它的感染常与多性伴和吸毒等行为紧密相关。感染者不仅要面对HIV感染带来的身心痛苦，可能还要面对歧视，或是道德上的评判，对日常工作和生活造成严重影响。因此，对一个人做出艾滋病的诊断要十分慎重。实验室检测结果是做出感染HIV诊断的惟一依据，所以，艾滋病的检测与其他大多数传染病的检测不同。其检测方法和结果报告要严格按照国家规定的程序进行，以维护受检者的合法权利。6目前我省实验室数截止到2007年8月底我省共有艾滋病检测实验室497个〔1〕艾滋病确证中心实验室1个〔2〕艾滋病确证实验室2个〔3〕艾滋病筛查中心实验室18个

〔4〕艾滋病筛查实验室477个

7497个艾滋病检测实验室在各市分布8497个艾滋病检测实验室系统分布9人员、建筑、设备要求——见?全国艾滋病检测工作管理方法?附件10二.规章制度、平安守那么、SOP实验室管理制度实验室生物平安守那么标准操作程序〔SOP〕※样品接受，登记和处理※检测方法和步骤※仪器使用维护和校准※实验中的质量控制※结果解释与报告※保密程序※检测数据的记录与保存※追踪和处理※实验室的清理和消毒※实验室平安防护※实验室应急突发事故处理制度111213编写要求

1.SOP是书面质量体系中的一个很重要的局部。SOP是指导完成检测工作的一整套书面操作指南，因而每个实验室应就本实验室所有重要工作制定相应的SOP。2.每一个检测工程都应该制定一份SOP，其中包含有详细的操作程序，例如实验室实验条件(温度等)、仪器的使用和维护、试剂、质控品、校准品的使用等(设备和试剂盒说明书作为附录)，以防止或减少因不同的操作者所引起的误差。3.SOP由各岗位工作人员起草，实验室负责人审定。实验人员在操作时应该严格按照SOP进行，实验室主管人员应该督查实验人员执行SOP。必要时，SOP中的内容，如说明书或相关内容，应该在实验室主管人员的领导下进行修订.4.每年至少修订一次。修订后的SOP按审批程序批准后使用。14实验室应有的纪录1.工作人员培训纪录2.健康监护档案3.实验室出入登记〔外来人员〕4.仪器使用、维护、校准纪录5.实验室温度、湿度纪录6.各种试验的原始纪录7.样本接收、保存纪录8.试剂使用纪录9.废弃物处理纪录10.质量控制纪录15档案管理原始记录包括实验原始记录表、打印数据、膜反响条带或其照片、检测记录表、标本登记记录、标本保存记录以及仪器设备维修和校准记录等重要记录都应该妥善存档保存15年以上。推荐同时使用计算机保存各种文件和记录。内含病人姓名的所有工作记录一定要保密。参见?标准?第8页16三、实验室检测要求1.检测样本的管理2.检测方法3.试剂选择和使用4.试验结果的判定、结果报告5.质量控制171、检测样本的管理制定标准操作程序〔SOP〕，并严格按照要求去做样品采集、运输和保存样品的采集18采集病原微生物样本应当具备以下条件?病原微生物实验室生物平安管理条例?19采血针201.血清、血浆2.标本采集时应尽量防止溶血、长菌3.抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性4.冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合5.防止交叉污染标本的采集和保存21针头处理针头收集器正确的取针头方式22错误的取针头方式23采集样本的本卷须知保障工作人员、病人和环境的平安保证样品的质量〔防止溶血、及时别离血清、合理的存放〕样本的正确标示〔编号与登记表一致〕职业暴露的预防24样本的保存别离血清即时检测的样品〔1-2天内〕，可存放于2-8℃冰箱，最长时间一周。如需长期保存，应将别离的血清或血浆存放于-20℃冰箱内。选择适宜的冻存管。25样品的运送26样品包装采用ＷＨＯ提出的三级包装系统。第一层容器：装样品，要求防渗漏。样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的编号或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。第二层容器：要求耐受性好、防渗漏、容纳并保护第一层容器，可装多个第一层容器。将试管装入专用带盖的容器内，容器的材料要易于消毒处理。第三层容器：放在一个运输用外层包装内，应易于消毒。外面要贴标签〔数量，收、发件人〕。

27第一层容器第二层容器第三层容器28平安运送：无损坏，不倾倒，无泄漏。及时运送：按时送到，不失时效必要条件：保证适宜温度，不受污染，无失误：无地址人名不清，造成错送或延误。感染性样本的运输要求29感染性样本的运输要求30可感染人类的高致病性病原微生物菌〔毒〕种或样本运输包装标识1.高致病性病原微生物危险标签

高致病性病原微生物制冷剂：

请勿自行打开如有破损、渗漏或遗失请立即通知当地卫生行政部门联系人：联系电话：2.高致病性病原微生物运输登记表

3.外包装放置方向标识

312、HIV实验室检测方法分类一.抗体检测(IgG,IgM,IgA…)初筛实验ELISA(EIA)第四代胶体金/硒层析、渗滤明胶颗粒凝集凝集法确认实验蛋白印迹(WesternBlot,WB)免疫荧光(IFA)二.抗原检测(P24)三.核酸检测(RNA,DNA)四.病毒别离32抗体检测抗体检测诊断的金标准：HIV特异性抗体检测EIA〔高敏感性〕+WB〔高特异性〕诊断的准确率大于99%，假阳性率约为0.0006%，造成错误诊断的时机几乎是0。抗体检测唯一的问题是窗口期可以出现假阴性33实验前试剂准备1.观察外包装，内主份有无漏液，注意效期等。2.仔细阅读说明书，严格按照试剂说明书进行操作。3.操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟，保证酶等液体的初始反响温度及活性剂的溶解。4.核对样本编号5.检查孵育温度6.检查洗板机管道的畅通及程序7.一次性手套、隔离衣、口罩等8.消毒物品9.污物桶、缸10.做好试验原始记录34厂家方法包被抗原CUTOFF值阳性对照阴性对照条件北京万泰酶免未注明阴性均值NC+0.12Ⅰ，Ⅱ型各1孔≥0.83孔≤0.1北京金豪酶免gp41;gp36;ENV180.10+N(均值）2孔2孔小于0.02按0.02计算P小于0.5，N大于0.1实验无效安图绿科酶免未注明0.10+N(均值）2孔3孔P大于0.7，N小于0.1，P-N大于0.6实验无效英科新创酶免未注明0.10+N(均值小于0.05按0.05算）2孔2孔P大于N0.6以上，N小于0.1，实验有效珠海丽珠酶免未注明0.15+N(均值）2孔≥0.83孔≤0.12，≤0.08按0.08算阳性对照孔间差大于30%，实验无效英科新创胶体金gp120;gp41;gp3630分钟内判定结果上海科华胶体金gp160;gp41;gp36无30分钟内判定结果美国雅培层析法未注明最少15分钟最多60分钟判定结果35加样过程应注意的问题1.血清或血浆标本别离不好即进行加样。2.漏加样品或加样量缺乏。3.加液器的校正。4.手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长。

36温育过程中出现的问题及解决方法1.温箱温育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底；2.温育时间人为延长，导致非特异性结合，难以清洗彻底。3.温育时温度不符合说明书的规定范围。1.按规定加盖封板膜。2.按说明步骤严格控制温育时间。3.严格控制温育仪器〔水浴箱、孵箱、全自动酶免〕的温度，建议在仪器内放置测量工具〔全自动酶免除外〕。37洗板过程中易出现的几点情况1.采用手工洗板,孔与孔之间液体容易交叉，切不可随意洗板。2.采用洗板机洗板时，洗液注入孔中量缺乏，导致洗板不彻底，造本钱底高。3.由于血液中纤维蛋白原，造成洗板针堵塞，抽吸不完全，造成洗板不畅，导致洗板效果差，直接影响本底。4.反响板过多，不能保证及时洗板，造成洗板等待时间过长，影响结果。5.洗板前先将孔内液体甩出包被板。38显色过程中易出现的问题1.显色剂配制后放置时间过长或使用已经变色失效的显色剂；2.用排枪加A、B混合液时，加样槽不够干净，造成花板。3.不同厂家试剂的显色液混用。39终止和读数时的本卷须知1．加完终止后30分钟内读取数据。2．读板时板底如果不清洁，就会导致所读的数据不准确，所以在读数前尽量保证酶标板的底部是清洁的。40初筛试剂的选择412007年山东HIV抗体诊断试剂临床质量评估〔ELISA〕结果试剂真阴性真阳性假阴性假阳性敏感性%特异性%功效率%丽珠66310310095.6597.00BioMerieuxAg+Ab66310310095.6597.00万泰66310310095.6597.00新创66310310095.6597.00金豪65310410094.2096.00绿科65310410094.2096.00高达65310410094.2096.00422007年山东HIV抗体诊断试剂临床质量评估

〔快速〕结果试剂真阴性真阳性假阴性假阳性敏感性%特异性%功效率%Determine68310110098.5599.00中新科炬68310110098.5599.00中山生物68310110098.5599.00科华68310110098.5599.00Bioline68310110098.5599.00新创67310210097.1098.00PA65310410094.2096.0043ELISA和PA对强阳性样品的滴度测定稀释度252627282929210211212ELISA(O.D.)OverOverOverOver2.8962.5612.4972.3852.372PA+++++++++稀释度213214215216217218219220221ELISA(O.D.)1.9941.5481.2781.1650.9320.9430.7900.6880.474PA+++++++++稀释度222223224225226227228229230ELISA(O.D.)0.3680.3450.2680.2420.2470.2350.1520.1170.105PA+±±±－－－－－所用ELISA试剂为生物梅里埃HIV½试剂盒,其Cutoff值为0.15044ELISA和雅培测定比照编号12345678910靶值3.002.932.672.351.320.720.510.050.040.02ELISA结果+++++++---雅培结果+++---+---雅培结果+++---+---雅培结果++++------雅培结果+++---±---雅培结果+++-------雅培结果++++-++---雅培结果+++--+----雅培结果++++------雅培结果+++-+-----9个实验室结果均为+++-------所用ELISA试剂为丽珠HIV½试剂盒,其Cutoff值为0.23045结果判定?药品生产质量管理标准?〔GMP〕?新生物制品审批方法?于1999年3月26日经国家药品监督管理局局务会审议通过，现予发布。本规定自1999年5月1日起施行。CUTOFF值确实定：正常人标本测定人数应在400人份以上，所得数据经统计学处理。通常是阴性对照均值+常数严格按照说明书要求判定结果46报告1.对HIV抗体筛查试验，呈阴性反响者可出具“HIV抗体阴性〞报告。2.对初筛试验呈阳性反响者不能出阳性报告，可出具“HIV抗体待复查〞报告。47临床由于HIV检测导致的医疗纠纷48例如149例如2:王××女21岁504、质量控制实验室内部质量控制 ——样品接收-处理-检测-报告样品保存实验外对照质控品的应用质控图标准操作程序设备/环境质控数据质控……51内、外部对照质控血清1、内部对照质控血清是指每个试剂盒内厂方提供的一套阴性和阳性对照〔弱阳性对照〕2、是为了监控实验的重复性和试剂盒的稳定性而由实验室自己制备的对照。3、理想的外部对照应该包括阳性对照、弱阳性对照、临界值对照和阴性对照。在每次实验时应设置一个单一浓度水平的质控品即弱阳性对照。这个弱阳性对照的值以设定在该试剂盒Cut-off值的2－3倍为宜。52外部对照质控血清的来源和选择1〕通过向有关机构购置获得2〕通过实验室制备获得(比较经济的方法)53制备外部对照的方法1.阳性血清2.阴性血清〔稀释血清〕3.临界值对照的OD/CO+2~3倍4.重复20次结果绘制质控图5.外部对照3000rpm15min去除沉淀，用0.2m生物滤膜过滤除菌后，56℃加热30min灭活处理，分装，-20℃保存备用。54外部对照质控血清的保存1〕外部对照血清或血浆的一次制备量应该足够本实验室一年使用2〕外部对照血清应该均一、无菌3〕外部对照血清标定后应该等量分装，每个分装的量应足够一周使用4〕外部对照应该分类作好标记5〕外部对照血清应该存放在－70℃，如无条件那么存放在非自动除霜的－20℃冰箱6〕外部对照血清一旦融解以后应该存放在2－8℃，一周后必须弃去，不能重新冻存。5520次外部对照的OD值56建立质控图参数5758质控图的判定和分析告警〔12S〕：当质控物的测定值超出+2s范围时，系统处于告警状态，应予注意，