食品毒理学 化学毒物的免疫毒性学习课件

PAGEPAGE1第十章化学毒物的免疫毒性免疫系统对于防御病原体的入侵和维持机体自身的稳态有十分重要的作用。早在20世纪初人们就注意到职业接触化学物所致的免疫损伤现象，还发现不少食品、药品、香料及日用化学品能引起过敏反应。进一步研究发现，外来化合物对免疫系统的影响出现早，损害剂量低，且个体差异大。对免疫毒性的研究既为化学物的毒性评价提供了早期诊断指标，也拓展了化学物毒作用机制的研究范围，由此逐渐形成了毒理学的分支学科—免疫毒理学。不同化学毒物可通过干扰神经内分泌网络等，使机体免疫功能低下即免疫抑制，导致个体易受感染因素或肿瘤等的攻击；也可影响免疫细胞的抗原识别能力或敏感性，引起病理性免疫应答，表现为过敏反应或自身免疫性疾病。化学物对免疫系统的作用具有双相性，同一化学物可在不同条件下分别表现为对机体的免疫抑制或过敏。免疫毒理学的主要任务就是研究化学毒物与免疫系统的相互作用，借助于啮齿类动物试验，监测和评估化学毒物引起的免疫系统的不良反应，进而确定其对人类健康的影响及其防治措施。第一节机体免疫系统及免疫功能免疫系统由中枢淋巴器官、外周淋巴器官、免疫细胞和免疫分子组成，是机体免疫机制发生的物质基础。免疫系统中不同的免疫细胞和免疫分子协同作用产生免疫应答，识别和清除外来异物，对机体进行防御和保护。根据其功能不同可将整个系统分成三个组织层次：①免疫组织与器官；②免疫细胞；③免疫分子。各层次不同类型的组织和细胞又有着不同的作用，通过淋巴细胞再循环和各种免疫分子将各部分的功能协调统一起来。免疫系统有着一系列的内部调节机制，但不是完全独立运行，而是与其它系统互相协调，尤其是受神经体液调节，又可进行反馈影响，共同维持机体的生理平衡。一、免疫应答的类型及作用抗原性物质进入机体后激发免疫细胞活化、分化和效应的过程称为免疫应答，是机体对外来物质侵入机体的自身防御反应。在体内有两种免疫应答类型，一种是遇到病原体后，首先并迅速起防御作用的，称为固有性免疫应答。执行固有免疫功能的有皮肤、黏膜的物理阻挡作用及局部细胞分泌的抑菌、杀菌物质的化学作用；有吞噬细胞的吞噬病原体作用；自然杀伤细胞（NK）对病毒感染靶细胞、肿瘤细胞的识别及杀伤作用以及血液和体液中存在的抗菌分子，如补体成分的细胞溶解作用。固有免疫在感染早期（数分钟至96h内）执行防御功能。另一种是适应性免疫应答，其执行者是T及B淋巴细胞。T及B细胞识别病原体成分后被活化，活化后并不即刻表现防御功能，而是经免疫应答过程，4～5d后，才生成效应细胞，对已被识别的病原体施加杀伤清除作用。适应性免疫应答是继固有性免疫应答之后发挥效应的，在最终清除病原体、促进疾病治愈及防止再感染中起主导作用。适应性免疫应答又根据其效应机制可分为以B细胞介导的体液免疫和以T细胞介导的细胞免疫两类。这两类免疫应答都是由多细胞系，如单核吞噬细胞，T细胞和B细胞等来完成的。二、免疫细胞在免疫系统中有许多类型的细胞，这些细胞中的大多数为淋巴细胞，包括B细胞和T细胞及NK细胞。此外还有各种粒细胞、肥大细胞、单核吞噬细胞以及各种辅助细胞。免疫细胞均由骨髓中造血干细胞的两大谱系分化而来：即淋巴干细胞和骨髓干细胞谱系。前者分化发育为各种淋巴细胞，后者分化发育为粒细胞、肥大细胞、单核吞噬细胞及辅助细胞。单核细胞在离开血液进入组织时进一步分化成巨噬细胞。淋巴细胞共有三种类型：T淋巴细胞、B淋巴细胞和非T非B淋巴细胞或称裸细胞，最常见的是自然杀伤细胞。大部分免疫细胞以白细胞形式在血液中循环，小部分存在于组织中，在必要时对抗损伤和感染。肥大细胞和巨噬细胞与其它免疫细胞不同，只存在于组织中，在血液中很少见。淋巴细胞和非淋巴细胞在免疫系统中都有各自的功能，对免疫应答起着重要的作用。1．B淋巴细胞B淋巴细胞为骨髓依赖的淋巴细胞的简称。B淋巴细胞在鸟类法氏囊中发育成熟，在哺乳类和人类则在骨髓中发育成熟。成熟的B淋巴细胞可定居于淋巴结的皮质区和脾脏的红髓及白髓的淋巴小结内。外周血中B淋巴细胞占淋巴细胞总数的10%～25%，淋巴结占20%～25%，脾脏中占40％～50％。已证明，B细胞在骨髓内的发育，可经过祖B细胞、前B细胞、不成熟B细胞、成熟B细胞及浆细胞几个阶段。B细胞的一个重要特征是细胞膜表面带有自己合成的免疫球蛋白，即膜免疫球蛋白（mIg）。在抗原的诱导下B细胞分化为浆细胞，可分泌与膜抗体相同的免疫球蛋白（Ig），只是比膜免疫球蛋白缺少了一段穿膜肽，即抗体。一种浆细胞只能产生一种类别的Ig分子，并且丧失产生其它类别的能力。浆细胞寿命较短，其生存期仅数日，随后即死亡。免疫球蛋白单体分子由两条较长的重链和两条较短的轻链组成，链间二硫键连结起来的大分子。免疫球蛋白在木瓜酶和胃蛋白酶作用下可裂解成Fab片段，具有抗原结合能力和Fc段。根据免疫球蛋白重链抗原特异性不同，将免疫球蛋白分为5类，即IgG,IgM,IgA,IgD,IgE。同类Ig分子还可进一步分为亚类。2.T淋巴细胞T淋巴细胞是胸腺依赖的淋巴细胞的简称。T淋巴细胞来源于骨髓淋巴干细胞，在胸腺内发育成熟后，分布于周围淋巴器官。在胸导管中有90%以上是T淋巴细胞，在外周血中占淋巴细胞的60%～80%，在淋巴结中占70%～75%，在脾脏中占40%～50%。T淋巴细胞膜表面具有多种膜抗原成分，国际上用CD，即分化抗原来命名。除此之外，T淋巴细胞表面还有多种表面受体，即T细胞抗原受体(TCR）、促有丝分裂素受体、白细胞介素受体（IL-R）及黏附分子受体等。抗原受体是T淋巴细胞识别外来抗原并与之结合的特异受体，而且外来抗原只有与自身MHC抗原结合后，才能被T细胞识别。T细胞表达的TCR是双肽链分子，按肽链编码基因不同，分为TCRαβ及TCRγδ两类。在外周中，绝大部分T细胞表达TCRαβ，只有1%～5%的T细胞为TCRγδ。但在表皮及小肠黏膜下，TCRγδ细胞占明显优势。T细胞的特异免疫应答主要是由αβ+T细胞完成。位于表皮及肠黏膜下的γδ+T细胞只能识别多种病原体表达的共同抗原成分，增殖、分化为效应细胞后，能杀伤病原体感染细胞及肿瘤细胞，故γδ+细胞执行的是固有免疫功能。根据T淋巴细胞的表面标志及功能的不同，可分为细胞毒性T细胞（cytotoxicTcells，Tc），其效应是对靶细胞（病毒感染细胞及肿瘤细胞）施加杀伤作用；调节T细胞（regulatoryTcells)，按调节功能不同，又分为辅助性T细胞（helperTcells，Th）和抑制性T细胞（suppressorTcells,Ts)，前者经其分泌的细胞因子，正反馈调节各种免疫细胞功能；后者抑制其它免疫细胞功能，负反馈调节免疫应答。Th细胞呈CD4+，而Ts/Tc则呈CD8+。3．单核吞噬细胞有吞噬功能的细胞有单核吞噬细胞及嗜中性粒细胞。单核吞噬细胞是除淋巴细胞外免疫系统中第二大的细胞群。所以这里着重讨论单核巨噬细胞。单核细胞起源于骨髓干细胞，在骨髓中发育为单核吞噬细胞进入血液，随着血流移行到全身各组织器官内。因此，单核吞噬细胞系统包括骨髓内的前单核细胞、外周血中的单核细胞和组织内的巨噬细胞。巨噬细胞在不同的器官组织中有不同的名称，如肝脏中的枯否（kupffer）细胞、肺脏中的肺泡巨噬细胞、胸腔和腹腔中的巨噬细胞及神经组织中的小胶质细胞等。巨噬细胞的表面标记有补体受体和Fc受体等，通过这些受体表现其吞噬作用、抗原呈递作用及分泌生物活性物质参与免疫应答等。4.自然杀伤细胞自然杀伤细胞（naturalkillercell,NK）是一群具有自然杀伤能力的淋巴细胞，它们不需经抗原刺激，也不需要抗体参与，就能杀伤肿瘤细胞、病毒感染细胞及移植的组织细胞，但对正常组织细胞无杀伤作用。NK细胞来源于骨髓干细胞，成熟的NK细胞离开骨髓进人外周血及周围免疫器官。人体外周血中NK细胞占淋巴细胞总数的5%~7%。NK细胞表面无T、B细胞特有的标志。CD16、NKH-1和CD2抗原是人NK细胞特征性抗原。三、免疫组织与器官免疫应答是通过体液免疫和细胞免疫介导完成的，它们都是外来抗原首先特异性地刺激了免疫细胞。这些免疫细胞是在适合于它们自己的组织器官中产生和发育成熟，并参与循环和转移到另外一些能与外来抗原接触的组织器官中去的。这些组织器官就是免疫器官。哺乳动物及人类的免疫器官有初级免疫器官（如骨髓和胸腺）及次级免疫器官（如淋巴结、脾脏、肠系淋巴组织等）。（一）淋巴器官1．骨髓2.胸腺3.淋巴结4.脾脏5.黏膜淋巴样组织（二）淋巴细胞的循环各种免疫器官中的淋巴细胞并不是定居不动的群体，而是通过血液和淋巴液的循环进行有规律的迁移（如图10一3），这种规律性的迁移称为淋巴细胞再循环。淋巴细胞经淋巴循环及血液循环，运行并再分布于全身各处淋巴器官及淋巴组织中。淋巴循环汇集于胸导管，再入上腔静脉，进入血液循环。淋巴循环的意义在于：①增加了与抗原、侵入物接触的机会，被活化的淋巴细胞变为效应细胞参与免疫应答；②能使B、T细胞和记忆细胞很快地分布到全身的组织器官。第二节化学毒物对机体免疫功能影响及其作用机制随着科学的发展与社会的进步，越来越多的化合物进入人类的生产和生活环境，其中有很多化合物的毒性作用广泛。近十多年的毒理学研究表明，由于免疫系统的特殊动力学特征，决定了其受毒物损伤较其它系统更为早期和敏感。化学毒物作用于免疫系统的重要靶部位如图10-4。皮肤、呼吸道和消化道有很大的表面积，是机体与外源性化学毒物接触的重要途径。在呼吸道，吸入外源性物质如氧化性气体和颗粒物（硅谷、石棉、煤尘等）可使肺上皮细胞和巨噬细胞产生多种活性物质，如白细胞介素1（IL-1），肿瘤坏死因子（TNF)、血小板源生长因子（platelet-derivedgrowthfactor,PDGF）、转化生长因子（transforminggrowthfactor,TGF)等。另外，肺泡巨噬细胞还分泌多种短活性物质，如氧化反应类物质超氧化物、氮氧化物、过氧化氢和花生四烯酸代谢产物等，可改变机体肺部对感染和炎症的抵抗力。同时，体液免疫功能抑制，可能提高机体对感染或肿瘤的易感性，发生炎症和退化反应。皮肤是免疫毒作用的重要靶器官，皮肤可与某些外源性化合物和化学致敏原（如一些化妆品等）、紫外线等起特异性应答或非特异性炎症反应，这两种反应均与诱导前炎症细胞因子有关。骨髓对毒作用最为敏感，临床使用的多种药物都有抑制骨髓功能，增加感染的危险性。许多新的免疫抑制剂均可抑制DNA合成而损伤骨髓功能。免疫系统作为化学毒物攻击的靶部位，其毒性反应可使免疫活性改变。免疫活性降低表现为免疫抑制，可增加对疾病的易感性，甚至导致反复、严重感染或诱发肿瘤；免疫活性增强可致免疫介导疾病发生，如超敏反应或自身免疫应答甚或自身免疫疾病。一、免疫抑制（一）具有免疫抑制的外源化学物(1)多卤代芳香烃类多氯联苯（PCB）、多溴联苯（PBB）、四氯二苯对二噁英（TCDD）、六氯苯（HCB）等。(2）多环芳烃类苯蒽（BA）、7,12-二甲基苯蒽（DMBA）、三甲基胆蒽（3-MCA）等。（3）农药类DDT、敌百虫、甲基对硫磷等。(4）金属铅、锡、砷、汞、镍、锌、铜、甲基汞等。(5）大气污染物二氧化氮、二氧化硫、臭氧、一氧化碳等。(6)工业污染物氯乙烯、苯、苯乙烯、联苯胺、三硝基甲苯、石棉等。(7)治疗用药物环磷酰胺、氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、5一氟尿嘧啶、环抱菌素A、雌二醇、白消安等。（二）外源化学物对免疫功能的抑制作用近年来，随着细胞生物学和分子生物学的迅速发展，对外源性化学物导致免疫系统毒性的作用机制也有了较大发展。外源性化学物是通过多种物质介导、多种作用途径而使机体的体液免疫、细胞免疫和巨噬细胞等功能下降，宿主抵抗能力改变，从而表现为免疫抑制。1．核因子与免疫抑制(1)核转录因子KappaB与免疫抑制转录因子KappaB即κ基因结合核因子(Nuclearfactor－κ－genebinding,NF－κB）是许多细胞因子的调节剂，在正常淋巴细胞活化中可调节许多重要基因的表达。近年的免疫研究表明，免疫抑制剂如糖皮质激素、苯的代谢产物氢醌、二甲基二硫代氨基甲酸酯等，均可通过抑制NF－κB而发挥其免疫抑制作用。多种免疫抑制剂或外源性化学物质可使NF－κB合成减少，和／或IκBs合成增加，或者也可以通过抑制正常时能激活NF一κB的各种活性物质等，从而抑制NFκB正常免疫功能。(2)T细胞活化核因子与免疫抑制如临床上用于治疗骨髓移植排斥的药物环霉素A（CsA)，可优先作用于T细胞，抑制T细胞TCR的信号途径。2．第二信使与免疫抑制外源性化学物可以作用于细胞内第二信使通路中的各个环节，如酪氨酸磷酸化作用、CAMP和钙等，从而使第二信使介导的免疫过程发生变化，最终导致免疫抑制。如上所述，多种化学物可致机体免疫抑制。凡具有免疫抑制的化学物均能降低机体对细菌、病毒、肿瘤及寄生虫的抵抗力。临床上由于采用免疫抑制剂治疗某些疾病导致机体免疫功能下降，往往引起由细菌、病毒、霉菌及寄生虫感染导致的严重合并症。而且由于免疫抑制作用，引起继发性癌症发生率增高，如果治疗停止后，继发癌症可部分或完全消失。二、超敏反应超敏反应（hypersensitivity)又称变态反应（allergy），是指机体对某些抗原初次应答后，再次接受相同抗原刺激时，发生的一种以机体生理功能紊乱或组织细胞损伤为主的特异性免疫应答。变态反应与免疫反应本质上都是机体对某些抗原物质的特异性免疫应答，但变态反应主要表现为组织损伤和／或生理功能紊乱，免疫反应则主要表现为生理性防御效应。（一）外源性化学物引起的超敏反应在生活中，由于职业暴露、空气污染、化妆品等使机体通过各种途径接触各类化学物质，均可引起各型变态反应，多表现为皮炎、哮喘等。现仅就引起较常见的这两种过敏性疾病做一介绍。(1)接触性皮炎某些染料、油漆、金属、塑料、药物等物质与人体接触，使机体致敏，机体再次接触同样的物质，能发生湿疹样反应称接触性皮炎。这类接触性皮炎约占整个职业性皮炎的60％。是由致敏T淋巴细胞引起的Ⅳ型变态反应，表现为红肿、硬结，严重的反应可引起局部组织坏死、皮肤溃疡及剥脱性皮炎。其组织学表现为血管周围有单核细胞，在表皮与真皮间发生水肿。除了职业接触有毒的化学物质外，一些化妆品对某些过敏个体也会引起超敏反应。化妆品的不良反应往往只来自其中某一成分。较易引起不良反应特别是炎症反应的是化妆品中的香料（肉桂叉、秘鲁香胶等），防腐剂（对羟苯甲酸酯类等），颜料（D-C黄11、曙红等），基质（鲸蜡醇、硬脂醇、羊毛脂、1,2一丙二醇等）等组分。(2)过敏性肺病在过敏性肺病中，最具代表性的是哮喘。在欧洲和美国职业哮喘人群为0.2％～6％，日本约有15％的哮喘病例与职业有关。甲苯二异氰酸酯（TD1）是异氰酸酯类化合物，广泛应用于制造泡沫塑料、黏合剂、橡胶、合成纤维、特种油漆等，对黏膜有刺激作用和致敏作用。另外，各种刺激性气体，如氯、氨、氮氧化物、光气、氟化氢、二氧化硫、三氧化硫和硫酸二甲酯等；一些高分子化合物，如酚醛树脂遇热释放出苯酚和甲醛具有刺激作用，聚四氟乙烯塑料受高热分解出四氟乙烯、六氟丙烯、八氟异丁烯，吸入后引起化学性肺炎或肺水肿。（二）外源性化学物引起超敏反应的机制1963年Gell和Coombs根据超敏反应发生的机理和临床特点，将其分为4种类型，见表10一1。1．I型超敏反应I型超敏反应发生速度快，也称速发型超敏反应（immediatehypersensitivity）或变态反应。经呼吸道、皮肤或消化道接触适当抗原，接触部位的淋巴组织，如扁桃体、支气管淋巴结、消化道淋巴组织产生的IgE水平最高，但脾脏产生的最低。血清中IgE浓度也较低，且其生物半衰期短。IgE一旦产生即与局部组织肥大细胞结合，进入循环后与远部位的循环肥大细胞、嗜碱性粒细胞和组织肥大细胞结合。当再次接触抗原时，即可引起肥大细胞脱颗粒，释出预先形成的介质和Th2型细胞因子，诱导合成白三烯（leukotrienes，LTs)和血栓素（thromboxanes）。这些介质促进血管扩张、支气管收缩和炎症反应，临床表现多样，从皮肤荨麻疹到枯草热体征，或更为严重疾病如严重的过敏症。2．Ⅱ型超敏反应Ⅱ型超敏反应也称抗体依赖细胞毒超敏反应，由抗体介导。涉及的抗体包括IgG和IgM。组织损伤可由于细胞毒素的直接作用而引起，如巨噬细胞、中性粒细胞或嗜酸性粒细胞通过细胞表面的Fc受休与抗体覆盖靶细胞结合，或通过经典途径激活补体系统，补体激活引起补体C3b或C3d结合在靶细胞表面，对效应细胞起趋化作用。另一方面，膜攻击复合物也与靶细胞表面结合，而使靶细胞溶解。3．Ⅲ型超敏反应Ⅲ型超敏反应也涉及IgM和IgG。不同的是，Ⅱ型是抗特异性组织相关抗原，Ⅲ型则是抗血清可溶性抗原。其结果是在免疫复合物沉积部位引起广泛组织损伤，最常见的部位是在肺、关节和肾的血管内皮，皮肤和循环系统也可累及。其病理是由于抗原-抗体复合物激活补休系统而引起的炎症反应。巨噬细胞、中性粒细胞和血小板被吸附到复合物沉积部位促进了组织损伤。故此型超敏反应也称免疫复合物介导超敏反应。4．Ⅳ型超敏反应（细胞介导超敏反应）Ⅳ型或称迟发型超敏反应（delayedtypehypersensitivity，DTH）可分为两型：接触超敏反应和结核菌素超敏反应。接触超敏反应是始发于皮肤表面接触抗原，且最初病变在表皮，临床特征是在接触变应原部位湿疹样反应，并由两相组成：致敏和激发。半抗原穿透表皮并与蛋白载体形成一种复合物即发生致敏。半抗原-载体复合物经朗罕树突状细胞处理后，由表皮迁移至局部淋巴结，在此由APC将经处理的抗原呈递给CD4+T细胞。导致克隆扩增并产生记忆T细胞。激发是当第二次接触抗原时，朗罕树突状细胞再次迁移至淋巴结并呈递经处理的半抗原-载体复合物给记忆T细胞，这些被激活的T细胞分泌细胞因子，并使T细胞进一步增殖和诱导皮肤的角质细胞和内皮细胞表面表达黏附分子。黏附分子的表达和由T细胞、角质细胞分泌的前炎症细胞因子促进炎症细胞迁移至皮肤，导致红斑、丘疹和水疤形成。Coombs和cell将超敏反应分为4种类型有助于理解其发生机制。而在病理上经常是几型超敏反应机制联合作用的结果。除此之外，有关的炎症反应可能是非免疫急性反应和／或免疫一介导反应，如由酸醉引起的支气管上皮损伤，细胞因子释出诱导非免疫炎症反应，化学物对炎症细胞的直接作用并刺激传人迷走神经，导致反射性支气管收缩和超敏反应，因此该化学物损伤机制显示了非免疫机制和4种类型免疫介导超敏反应机制的联合作用。三、自身免疫应答机体对自身组织成分或细胞抗原性失去免疫耐受性，导致自身免疫效应细胞和自身抗体产生，称为自身免疫。自身免疫反应达到一定强度以致破坏正常组织结构并引起相应临床症状时，就称为自身免疫病。（一）引起自身免疫病的外源化学物目前已发现许多外源化学物可改变自身细胞的抗原性质或出现新的抗原性，引起自身免疫病，尤其是在易感个体。其中研究最多的是药物，如肼苯哒嗪和普鲁卡因酰胺等药物可与细胞内组蛋白或DNA结合，导致抗核抗体的产生，长期使用可引起系统性红斑狼疮样症状。而长期服用药物α甲基多巴的病人，可以诱发抗红细胞抗体发生自身溶血性贫血。外源物质代谢酶是自身免疫疾病特异性抗体潜在的靶子，抗外源物质代谢酶自身抗体，其中最常见的是抗CYP450。药物代谢后形成的反应性代谢产物可聚集在这种代谢酶上，以增加新抗原的量并可保护细胞免受反应性代谢产物的毒作用，一旦形成新抗原，即被呈递至免疫系统，引发自身免疫应答。第三节免疫毒理学检测一、免疫毒性检测方案大多数化学物对人体产生免疫毒性的潜在性评价是建立在动物试验的多础上．很多用于动物研究的试验近似于或至少类似于上面所提及的临床评价．然而，在动物中直接用于检测毒性终点的研究．如免疫病理的发展或感染性疾病扰性的缺失，就难于或不可能应用于临床评价。1.小鼠免疫毒性检测方案参考国外学者推荐的免疫毒性检测方案，考虑到目前我国免疫毒理学工作开展的现况，我国学者推荐了国内进行免疫毒性检测的方案(表10-7)。表10-7国内推荐的实验动物免疫毒性检测方案(北京医科大学毒理室，1991)项目检测内容病理毒性脏器重量：体重、脾脏重、胸腺重一般血液学检查：白细胞总数及分类体液免疫对胸腺依赖抗原——羊红细胞的抗体空斑反应(PFC)血清抗体滴度(血凝法、ELISA法)用有丝分裂原(LPS)刺激淋巴细胞转化细胞免疫T细胞数——ANAE染色法用有丝分裂原(ConA、PHA)刺激淋巴细胞转化迟发型变态反应(DTH)巨噬细胞功能腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬作用单核巨噬细胞对碳粒的廓清能力宿主抵抗力对肿瘤细胞的敏感性(TD10-20)内毒素的过敏反应(LDl0-20)2..人群免疫毒性检测方案80年代由美国国家研究委员会(NationalResearchCouncil，NRC)提出的人群免疫毒性检测方案分为三个阶段，所有接触免疫毒物的人均需进行第一阶段检测，在第一阶段检测中发现有异常的人及选择部分接触人群进行第二阶段检测，第三阶段检测是在第二阶段中发现有异常的人中进行。世界卫生组织(WHO)也对人群免疫毒性检测提出建议，在WHO推荐的方案中包括七个方面：血液学检查、体液免疫、细胞免疫、非特异性免疫、淋巴细胞的表面标记、自身抗体、临床化学检查等。表10-8为WHO提出的人群免疫毒性检测方案。表10-8WHO推荐的人群免疫毒性检测方案(WHO，1992)1全血细胞计数及分类2抗体介导免疫(检测一项或多项)对蛋白抗原的初次抗体反应血清中免疫球蛋白水平(IgM，IgG，IgA，IgE)对蛋白抗原的二次抗体反应(白喉、破伤风或脊髓灰质炎)对回忆抗原的增殖反应3用流式细胞仪分析淋巴细胞的表型分析淋巴细胞表面标记Cly3，CD4，CD8，CD204细胞免疫用试剂盒检测皮肤迟发型过敏反应对蛋白抗原(KLH)的初次DTH反应对血型抗原的天然免疫(如抗A，抗B)5自身抗体和炎症C—反应蛋白自身抗体滴度对过敏原产生的IgE水平6非特异性免疫的检测NK细胞数(CD56或CD60)或对K562细胞的溶解性吞噬作用(NBT或化学发光)7临床化学指标检测二、免疫抑制的检测方法1.免疫病理学检查包括淋巴器官重量、病理检查及流式细胞术检测细胞表面标记。(1)淋巴器官重量：实验动物接触外源化学物后，对免疫系统的毒性作用可表现为淋巴器官重量的改变。通过称重了解淋巴器官重量的变化，最常用来检测淋巴器官重量的是胸腺、脾脏、淋巴结。根据接触外源化学物的途径，对不同部位的淋巴结进行称重，如经口接触则对肠系膜淋巴结称重，经呼吸道接触对支气管淋巴结称重。进行肠系膜淋巴结称重时应注意将周围的脂肪组织去除干净，以保证称重的准确。(2)病理检查：除对胸腺、脾脏及淋巴结进行病理检查外，根据暴露途径的不同，对粘膜免疫系统和皮肤免疫系统的组织病理也应进行检查。开始用常规的苏木素—伊红染色，进一步针对特殊的细胞类型可采用免疫酶染色法。有许多单克隆抗体可用来对小鼠、大鼠及人的免疫细胞的分化抗原、细胞粘附分子及活化的标记进行测定。组织病理学的检查只能对所产生的影响做半定量的估计。(3)FACS检测细胞表面标记：荧光激活的细胞分类仪(fluorescenceactivatedcellsortor，FACS)是用于流式细胞术的一种自动分析仪器，利用免疫荧光与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种技术，进行细胞和分子水平研究。用FACS分析外源化学物对细胞表面标记的影响，是鉴定化学物免疫毒性十分敏感的指标。2.淋巴细胞增殖反应淋巴细胞增殖试验是测定B淋巴细胞和T淋巴细胞功能的简便方法，重复性也较好。在进行该试验时需用有丝分裂原刺激淋巴细胞转化，常用的有丝分裂原有细菌脂多糖(LPS)、植物血凝素(PHA)、刀豆素(ConA)等，LPS主要刺激B淋巴细胞，PHA、ConA刺激T淋巴细胞。经刺激后增殖的淋巴细胞用形态学方法、同位素掺入法和比色分析法进行检测。形态学方法简单，在光学显微镜下计数转化细胞，但客观性差。同位素掺入法常用3H—TdR掺人到DNA后，用液体闪烁仪进行测定，以cpm数来表示转化程度，在一般实验室进行。1983年Mosmann介绍一种比色分析测定活细胞及增殖细胞，它的原理是产生甲躜(fonnazan)。甲躜是一种紫色结晶，用酸性异丙醇或二甲基亚砜溶解结晶后，在ELISA仪或721分光光度计上测定，根据颜色深浅判断淋巴细胞转化程度。该法简单、快速，在对一定数量细胞测定时，具有与同位素掺入同样的灵敏度，值得推广。淋巴细胞增殖反应在检测外源化学物对免疫系统毒性上不是一个灵敏的方法，这是因为细胞在体外培养条件下，需经几天时间才能达到反应的高峰，这段时间有些受到损伤的细胞得到恢复，这是体外试验或半体外试验中一个共同的问题。3.体液免疫功能有许多方法可用来检测体液免疫功能，包括抗体形成细胞(plaqueformingcell，PFC)、抗体产生的量及B细胞受体等。在检测外源化学物引起实验动物体液免疫功能变化上，最常用的方法是PFC测定。在PFC测定时需用抗原免疫动物，常用的抗原有绵羊红细胞(SRBC)、牛血清白蛋白(BSA)、钥孔嘁血蓝蛋白(KLH)及脂多糖(LPS)等。动物经SRBC免疫后4~5天，血清中出现特异性抗体，脾脏中有大量抗体形成细胞。对抗体可用血凝法、酶免疫吸附分析法(ELISA)、免疫电泳、免疫扩散等方法进行检测，对抗体形成细胞可用Jeme改良玻片法、Cunningham小室法进行测定，方法简单、特异，不需要特殊的仪器，在很多实验室里均可进行。实验结果以PFC／106脾细胞或PFC／全脾来表示，如果PFC减少与剂量有关，表明有免疫抑制作用。4.细胞免疫功能检测检测细胞免疫功能的方法有体内法和体外法。体内法包括迟发型变态反应、皮肤移植排斥反应、移植物抗宿主反应；体外法有淋巴细胞增殖、T细胞毒性及淋巴因子的产生等。体外法虽然经常采用，但是体内法测定迟发型变态反应应用更广。通常迟发型变态反应可以反映机体细胞免疫状况。对实验动物进行迟发型变态反应检测时，常用的抗原有KLH，BSA，SRBC等。它是将抗原定量注入皮内，24~48h后观察结果，若注射部位出现红肿、硬结为阳性结果。迟发型变态反应是在整体动物身上进行的试验，它比用体外试验更能反映外源化学物对机体免疫功能的影响。Luster(1992年)报道，在小鼠身上进行DTH反应测定，对鉴定外源化学物的免疫毒性有很好的预测价值，当与NK细胞检测及PFC测定结果一起进行分析，其预测价值就更高。5.NK细胞活性检测NK细胞在机体抗肿瘤、抗感染及免疫调节中起着重要作用，外源化学物对NK细胞活性的影响已越来越受到重视。检测NK细胞活性的方法主要有同位素释放法和乳酸脱氢酶(LDH)释放法。检测人NK细胞活性常用14562细胞株作为靶细胞，测定小鼠脾脏NK细胞活性用YAC-1细胞株作为靶细胞。同位素释放法虽较客观、灵敏，但需价格昂贵的仪器，并有放射性污染环境的问题。LDH释放法同样可得到客观、准确的结果，却无上述的缺点，因此它不失为检测NK细胞活性较好的方法。6.宿主抵抗力检测外源化学物诱发免疫毒性可表现为机体对感染因子或肿瘤细胞的抵抗力发生改变。宿主抵抗力的检测大部分是在小鼠身上进行的，包括对细菌、病毒、寄生虫及可移植肿瘤细胞的抵抗力，只有个别是在大鼠身上进行的。常用的细菌有李斯特菌、链球菌、绿脓杆菌等，病毒有脑炎—心肌病毒(EMC)、单纯疱疹性病毒(HSV)、流感A型病毒(FLU)等，常用的寄生虫有毛线虫和疟原虫，肿瘤细胞有PYB6细胞株，是由多形瘤病毒(Polymavires)在C57BL／6小鼠诱发的一种肿瘤，除此而外，还可用B16F10黑色素瘤细胞株、Madisonl09肺癌细胞株和LsL~s肺癌细胞株等。在进行宿主抵抗力检测时，所用感染因子的剂量及动物数是十分重要的，因为剂量太高太低都得不到满意的结果。在NIEHS实验室里过去所选用的剂量为使10％~30％对照组动物产生肿瘤或死亡，目前将所用的剂量略降低而使实验的敏感性有所提高。尽管很多宿主抵抗力试验在操作上很简单，但需要较多的动物，与免疫功能检测相比其敏感性较差。因此在免疫毒性筛选上，一般不做宿主抵抗力检测。三、超敏反应的检测方法1.皮肤超敏反应的检测外源化学物引起皮肤超敏反应的检测方法最常用的有两种，即局部封闭涂皮法(Buehlertest，BT)及皮内和涂皮相结合的方法(GuineaPigMaximizationTest，GPMT)，局部涂皮法用于强致敏物的筛选，致敏途径与实际接触途径相似，操作简便，但接触剂量不易控制。皮内和涂皮相结合的方法，致敏性强，检出率高，尤适于弱致敏物的检测，该两种方法均以豚鼠为实验模型，豚鼠实验方法繁杂，费用较贵，近年来发展两种检测方法，小鼠耳肿实验(mouseearswellingtest，MEST)及啮齿类局部淋巴结实验(murinelo-csllymphnodeassay，LLNA)由于方法简单，小鼠价格低廉，实验用材少，而且能较好的预测人群接触外源化学物的致敏性，得到广泛应用。2.呼吸道超敏反应的检测可采用激发试验、血清中IgE的检测及辅助T细胞(Th2)分泌的因子等。激发试验是模拟自然发病条件，以少量抗原引起一次较轻的超敏反应发作，用以确定过敏原的试验，主要用于I型超敏反应。常用的激发试验有支气管激发试验，鼻粘膜激发试验等，血清中IgE检测对I型超敏反应的诊断和超敏原的确定有价值，常用的检测方法有放射免疫吸附试验(BAST)、酶联免疫吸附测定(ELISA)及间接血凝法。四、免疫毒理学研究中应考虑的问题（一）体内试验1.实验动物选择在免疫毒理学研究中，最常用的是啮齿类动物，因为对啮齿类动物及其细胞成分了解的最多，而且有各种商品化的试剂。除啮齿类动物外，鱼类也用的较多，鱼类生活在自然环境中，是研究环境污染物对机体免疫功能影响很好的模型。在进行免疫毒理学研究时，最好选用纯系动物，这样可以减少个体差异，美国NTP推荐用B6C3F2.接触受试物的时间实验动物接触受试物时间的长短，对免疫系统的影响不同。对有些药物如抗菌素在临床上应用时间较短，实验动物接触1～2周即可，长时间的接触会产生耐受。然而对某些长期使用的药物，动物接触至少一个月，以评价药物的长期作用。3.接触受试物的剂量在进行免疫毒性检测时，应避免选用有明显一般毒性的剂量。为了确定剂量—反应关系及未观察到不良影响的水平(NOAEL)，至少应设三个剂量。高剂量要低于产生明显毒性的剂量，一般应低于LD10量应不引起免疫毒性，在高剂量与低剂量间设一中间剂量。选择适当的剂量是十分重要的，特别是对实验结果的解释上，不能受严重的应激及营养不良的影响与干扰。4.实验中用的抗原抗原的来源、给予途径、剂量、免疫后检测时间等均对免疫反应有一定的影响。羊红细胞(SRBC)是最常用的抗原，建议采用静脉注射途径，剂量以每只小鼠5×106～1.5×108个细胞为宜。5.注意免疫毒性的器官特异性如5—氟尿嘧啶抑制小鼠脾脏及肺脏的NK细胞活性，但却增强肠道NK细胞活性。6.重视局部免疫功能的检测有些外源化学物经呼吸道进人体内，其主要的靶器官是肺，因此对肺脏局部免疫的影响则应引起足够的注意。对肺部免疫功能的检测包括干扰素的产生、肺脏巨噬细胞功能、自然杀伤细胞活性、细胞毒性T细胞活性等。（二）体外试验体外试验常用在机理的探讨上，如果用体外试验进行安全性评价时，有以下几个问题：1.免疫系统是一个复杂的和由许多细胞、分子组成的精细的生理调节系统，任何一种体外系统都很难模拟。在体外细胞培养系统中可加人S9混合物，但S9也不能代表所有的代谢酶。2.细胞在体外生存环境发生很大变化，随着细胞在体外培养时间延长，传代次数增多，细胞的生理、生化、代谢方面都发生很大变化，这将影响实验结果。3.“神经—内分泌—免疫”三大系统在体内相互作用，相互制约，构成一个复杂的网络，任何环节的紊乱或失调都能直接或间接影响其他系统的功能，这三大系统也只有在体内才能发挥作用。正因为如此，有时体内、体外实验结果不一致，从而造成过高或过低估计免疫毒性效应，在进行安全性评价时用体外浓度难以推算体内浓度。（三）免疫功能改变的生物学及临床意义对实验动物免疫毒性检测应综合考虑其统计学的意义和生物学意义，特别是注意分析其剂量一反应和毒性的可逆性。而且，涉及多个细胞、多种成分的免疫功能改变要比单一的检测终点的改变更具有生物学意义。人群免疫毒性检测，对于确定外源化学物对人体免疫毒性有十分重要的意义。第四节检测食品中化学物免疫毒性的常用方法要鉴定食品中化学物对免疫功能的影响，必须建立一些灵敏、快速、特异的免疫学方法。由于免疫系统的复杂性，参与免疫应答的器官不是单一的，参与免疫反应的细胞也是多种多样的，因此要确定食品中某一化学成分对免疫功能的影响，决不是用一个实验就能说明的，需要进行一组实验来研究其对体液免疫、细胞免疫以及单核巨噬细胞的功能等的影响。（一）细胞学和免疫病理学检查可进行血液学检查，主要进行白细胞总数的测定和白细胞的分类计数。为了检测外源性化学物对实验动物机体的免疫功能是否有不良影响，在实验结束后常又要对其胸腺及脾等免疫器官及动物肝脏和肾脏进行大体观察，并称其重量，计算其脏器系数，必要时进行组织学检查。脏器系数是指每100g体重的某一脏器（湿重）的重量（g）。胸腺萎缩与否是评价细胞免疫功能状态的一个十分有用的指标，脾脏重量减轻或脾淋巴滤泡的萎缩表明机体的体液免疫功能降低。（二）细胞免疫功能的测定1.酸性α-醋酸萘酯酶（ANAE）测定淋巴细胞中含有各种酶类,不同的淋巴细胞亚群所含的酶类不同，其含量和酶谱均有不同。T淋巴成熟期可明显增加酸性α-醋酸萘酯酶的活性。因此可用细胞化学反应法检测ANAE，作为鉴别T淋巴细胞的一种方法。其检测原理是T淋巴细胞浆内的ANAE，在弱酸性条件下能使底物α-醋酸萘酯水解成醛酸和α-萘酚。后者与六偶氮副品红偶联，生成不溶性的红色沉淀物，沉积在T淋巴细胞浆内酯酶所在的部位。经甲基绿复染，反应颗粒变暗而呈红黑色。在显微镜油镜下观察ANAE阳性的淋巴细胞呈灰或灰绿色，胞浆内有大小不等、数量不一，界限分明的红黑色颗粒或斑块。ANAE阴性的淋巴细胞呈淡绿或棕黄色，无着色颗粒。每份标本至少计数100~200个淋巴细胞，求ANAE的阳性率。2.淋巴细胞转化实验可采用外周血分离淋巴细胞培养法或微量全血培养法。其原理是将外周血或分离的白细胞和植物血球凝集素（PHA）混合进行体外培养，数日后取培养细胞作涂片染色和镜检，可见大部分淋巴细胞转化为体积较大的原始淋巴母细胞，细胞核内生成核仁，并有部分细胞发生分裂的现象。由于PHA只激发T淋巴细胞转化，因此计数200个淋巴细胞，计算出转化细胞的百分率，即得淋巴细胞转化率（简称转化率）。T淋巴细胞主要参与机体的细胞免疫，故淋巴细胞转化实验反映的是机体的细胞免疫功能状态。此外3H-胸腺嘧啶核苷（简称3H-TdR）掺入实验也是体外淋巴细胞转化实验的一种方法，该方法客观、重复性好、结果准确。其原理是当淋巴细胞受到分裂原（如PHA等）或特异性抗原刺激而发生转化时，必然伴有DNA的大量合成，此时若将具有放射性的3H-TdR加到培养液内，则可作为DNA的原料被摄入转化的细胞内，因此测定细胞内放射性物质的相对数量（以脉冲数表示），就能客观地反映淋巴细胞对刺激物的应答水平。目前国外的免疫毒理学工作者常常选择混合淋巴细胞培养法来进行淋巴细胞转化实验。混合淋巴细胞培养又可分成双向法和单向法两种。双向混合淋巴细胞培养法的原理是将同种异体的淋巴细胞共同培养，由于相互刺激，使双方淋巴细胞发生增殖、分化和形态上出现母细胞化的转变。其增殖程度与不相容性程度成正比，因此免疫毒理学实验中常将淋巴细胞增殖程度看作为淋巴细胞反应能力强弱的标志。单向混合淋巴细胞培养法的原理主要是应用检测混合淋巴细胞培养中某一方淋巴细胞反应的能力，将另一方的淋巴细胞先以X射线或自力霉素C处理，使其失去增殖反应能力但仍保持抗原性，作为刺激细胞与被检淋巴细胞混合培养，以检测未经处理的被检淋巴细胞的增殖反应能力。3.二硝基氟苯诱导小鼠迟发型超敏反应迟发型超敏反应（DTH）是依赖T细胞的反应，其主要特征是致敏机体在抗原攻击部位出现迟发型炎症反应，又称接触性过敏反应。其检测原理是二硝基氟苯（DNFB）为一种半抗原，将其稀释后涂抹于动物的腹壁皮肤，4-7天后再将其涂抹于耳部或足、爪皮肤，使局部产生迟发型变态反应。一般在抗原攻击后24~48小时反应达到高峰，因此在此时测定肿胀程度。4.CD4／CD8比值的测定T细胞按其表面抗原及其在免疫应答中的功能分为CD4和CD8两大亚群。在正常免疫应答的情况上，T细胞亚群之间存在着促进或制约的关系，即CD4和CD8的比值是稳定的。而当CD4和CD8之间的平衡遭到破坏时，就会表现出异样的免疫应答，如免疫缺陷或自身免疫疾病。在免疫毒理学的实验中，测定CD4和CD8的比值可直接反应出细胞免疫的状况。此方法简单、快速、是国外免疫毒性实验的首选指标之一。目前检测CD4／CD8比值的方法有两大类，即免疫荧光法和免疫酶标记法。免疫荧光法的原理是将淋巴细胞加以分离，制成薄涂片，干燥固定后用荧光标记的CD单克隆抗体染色，洗去未结合的荧光抗体后，在荧光显微镜下观察结果，计算CD4／CD8比值。免疫酶法测定的原理基本与荧光法相同，只是实验中用兔抗鼠IgG抗体为二抗代替荧光抗体，加入酶底物后阳性细胞显色，用普通光学显微镜即可观察结果。（三）体液免疫功能测定1.溶血空斑实验该实验简称PFC实验，又称抗体生成细胞的检测，是体外检查和计数产生IgM及其他类型Ig抗体生成细胞的一种方法。琼脂平板溶血空斑实验的原理是将羊红细胞免疫4天的小鼠取出脾脏制成脾细胞悬液，在半固体琼脂凝胶介质中使脾细胞与羊红细胞混合，浇在平皿内使之形成薄层，37℃除琼脂平板溶血空斑实验也可采用琼脂玻片溶血空斑实验，其原理与琼脂平板法相同。间接进行溶血素测定（或半数溶血值测定）也可作为抗体生成细胞检测的方法。其原理是经绵羊红细胞免疫过的动物，其淋巴细胞可以产生抗体－溶血素，并释放至外周血中。分离出致敏动物的血清，与绵羊红细胞一起培养，在补体参与下可以产生溶血现象。致敏动物血清中溶血素的含量可以通过溶血过程中释放的血红蛋白的量测出。2.单项免疫扩散实验测定血清中