药品微生物检验技术 课件 模块三 项目一抑菌效力检查

《药品微生物检验技术》模块三药品有效性检查项目一抑菌效力检查

任务一试验菌的准备

任务二金莲花口服液的抑菌效力检查

目录项目一抑菌效力检查任务一试验菌的准备

任务引入请思考口服液中常含有苯甲酸钠、山梨酸钾等成分，它们的作用是什么？多剂量包装的制剂在正常贮藏或使用过程中，是否有可能发生的微生物污染和繁殖，使药物变质而对使用者造成危害？

任务分析

如果药物本身不具有充分的抗菌效力，那么应根据制剂特性（如水溶性制剂）添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常贮藏或使用过程中可能发生的微生物污染和繁殖，使药物变质而对使用者造成危害，尤其是多剂量包装的制剂。但是，抑菌剂的抑菌效力在贮存过程中有可能因药物的成分或包装容器等因素影响而变化，因此，应验证成品制剂的抑菌效力在有效期内不因贮藏条件而降低。

抑菌效力检查法系用于测定无菌及非无菌制剂中抑菌剂的抑菌活性，该检查应按照《中国药典》（2020年版）抑菌效力检查法（通则1121）的有关要求进行。任务分析工作内容工作要求关键点培养基制备选择正确培养基、完成制备计算、称量、调剂pH、分装、灭菌试验菌菌液制备方法正确、完成制备微量移液器使用、无菌操作、无菌环境维持1.口服液中可能存在的微生物有细菌和真菌，所以，试验菌应选择细菌和真菌。选择《中国药典》抑菌效力检查法（通则1121）规定的菌株，并按规定的培养温度、培养时间等条件对菌种进行培养，制备试验菌菌液。2.细菌和真菌生长时所需的营养成分及生长环境都有差别，因此，要分别选择适宜细菌、真菌生长的培养基。并按照《中国药典》中无菌检查法（通则1101）制备。工作内容及要求相关知识-抑菌剂

抑菌剂是指具有抑菌作用，能够抑制微生物生长、繁殖的化学物质，有时也称为防腐剂。抑菌剂能使病原微生物蛋白质变性；能与病原微生物酶系统结合；也能增加菌体细胞的通透性，使细胞膜破裂、溶解等。因此，抑菌剂对微生物繁殖体有杀灭作用，对芽孢有抑制作用，使其不能发育为繁殖体而逐渐死亡。抑菌剂常用浓度使用范围苯甲酸与苯甲酸钠0.25%～0.40%内服和外用制剂对羟基苯甲酸酯类（尼泊金类）0.01%～0.25%内服液体制剂山梨酸与山梨酸钾0.15%～0.25%内服和外用制剂苯扎溴铵0.02%～0.2%外用制剂三氯叔丁醇0.25%～0.5%外用制剂和一些注射剂药物制剂中一些常见的抑菌剂相关知识-培养基

抑菌效力检查中需要使用胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基。其中胰酪大豆胨液体（琼脂）培养基用于细菌的培养。沙氏葡萄糖液体（琼脂）培养基用于真菌的培养。相关知识-试验菌株

培养基适用性检查、方法适用性试验用菌株包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉菌。抑菌效力测定用菌株除上述菌株外，若需要，制剂中常见的污染微生物也可作为试验菌株，例如含高浓度糖的口服制剂还应选用鲁氏酵母为试验菌株。这些试验菌的新鲜培养物经稀释后制成浓度适宜的菌悬液或孢子悬液用于抑菌效力检查。相关知识-试验菌株

试验菌株试验培养基培养温度培养时间金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC（B）26003]胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基30～35℃18～24小时铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[CMCC（B）10104]胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基30～35℃18～24小时大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC（B）44102]胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基30～35℃18～24小时白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC（F）98001]沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基20～25℃48小时黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC（F）98003]沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基20～25℃6～10天或直到获得丰富孢子培养基适用性检查、方法适用性试验、抑菌效力测定用试验菌及新鲜培养物制备任务实施一、制订工作计划根据任务要求，制定合理工作进度计划，并根据小组成员的特点进行分工。序号工作内容完成时间成员负责人1胰酪大豆胨液体（琼脂）培养基制备

2沙氏葡萄糖液体（琼脂）培养基制备

3金黄色葡萄球菌菌液制备

4铜绿假单胞菌菌液制备

5大肠埃希菌菌液制备

6白色念珠菌菌液制备

7黑曲霉菌菌液制备

任务实施二、试验前准备设备、器材、试剂规格数量用途无菌室

操作场所超净工作台

操作区域酒精灯

局部无菌环境75%酒精

擦拭消毒培养基各试剂

配制培养基移液器

移取定量液体试管、试管架

容器、支架三角瓶

盛放培养基细菌培养箱、真菌培养箱

培养灭菌锅

培养基灭菌供试菌株

制备供试菌菌液补充1：

补充2：

任务实施三、试验操作序号步骤操作内容1选器具高压蒸汽灭菌器、电子天平、电炉、1000mL烧杯、玻璃棒、药匙、试管或锥形瓶、pH试纸等2取试剂取胰酪胨、大豆木瓜蛋白酶水解物、葡萄糖（或无水葡萄糖）、氯化钠、磷酸二氢钾、蒸馏水3称量电子天平称量胰酪胨___g、大豆木瓜蛋白酶水解物___g、葡萄糖（或无水葡萄糖）___g、氯化钠___g、磷酸二氢钾___g于烧杯中4溶解加水微温溶解，滤过，加水至培养基总体积为____mL5调节pH调节pH为____6加入葡萄糖称量葡萄糖（或无水葡萄糖）___g，加入培养基中7分装、包扎、灭菌将分装包扎好的培养基放入高压蒸汽灭菌器中，___℃,灭菌___min8保藏取出灭菌好的培养基，放至于_____保藏待用胰酪大豆胨液体培养基的制备任务实施序号步骤操作内容1选器具高压蒸汽灭菌器、电子天平、电炉、1000mL烧杯、1000mL量筒、玻璃棒、药匙、试管或锥形瓶、pH试纸等2取试剂取胰酪胨、大豆木瓜蛋白酶水解物、氯化钠、琼脂、蒸馏水3称量电子天平称量胰酪胨___g、大豆木瓜蛋白酶水解物___g、氯化钠___g于烧杯中4溶解加水微温溶解，加水至培养基总体积为____mL5调节pH调节pH为____6加入琼脂称量琼脂___g，加入培养基中，加热溶化，摇匀7分装、包扎、灭菌将分装包扎好的培养基放入高压蒸汽灭菌器中，___℃,灭菌___min8保藏取出灭菌好的培养基，放至于_____保藏待用胰酪大豆胨琼脂培养基的制备任务实施序号步骤操作内容1选器具高压蒸汽灭菌器、电子天平、电炉、1000mL烧杯、1000mL量筒、玻璃棒、药匙、试管或锥形瓶、pH试纸等2取试剂取动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物、葡萄糖、蒸馏水3称量电子天平称量动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物___g于烧杯中4溶解加水微温溶解，加水至培养基总体积为____mL5调节pH调节pH为____6加入葡萄糖称量葡萄糖___g，加入培养基中，摇匀7分装、包扎、灭菌将分装包扎好的培养基放入高压蒸汽灭菌器中，___℃,灭菌___min8保藏取出灭菌好的培养基，放至于_____保藏待用沙氏葡萄糖液体培养基的制备任务实施序号步骤操作内容1选器具高压蒸汽灭菌器、电子天平、电炉、1000mL烧杯、1000mL量筒、玻璃棒、药匙、试管或锥形瓶、pH试纸等2取试剂取动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物、葡萄糖、琼脂、蒸馏水3称量电子天平称量动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物___g于烧杯中4溶解加水微温溶解，加水至培养基总体积为____mL5调节pH调节pH为____6加入琼脂称量琼脂___g，加入培养基中，加热溶化7加入葡萄糖称量葡萄糖___g，加入培养基中，摇匀8分装、包扎、灭菌将分装包扎好的培养基放入高压蒸汽灭菌器中，___℃,灭菌___min9保藏取出灭菌好的培养基，放至于_____保藏待用沙氏葡萄糖琼脂培养基的制备任务实施培养基适用性检查用菌液制备序号步骤操作内容1选器具无菌试管、无菌移液管等2选药品pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液3选菌种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌，传代次数为___代4金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌

菌悬液制备取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。5黑曲霉菌菌悬液制备取黑曲霉的新鲜培养物加入适量含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的孢子悬液。6保存菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。黑曲霉的孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。任务实施抑菌效力测定用菌液制备序号步骤操作内容1选器具无菌试管、无菌移液管等2选药品0.9%无菌氯化钠溶液含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液3选菌种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌4金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌

菌悬液制备金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌若为琼脂培养物，加入适量的0.9%无菌氯化钠溶液将琼脂表面的培养物洗脱，并将菌悬液移至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释并制成每1mL含菌数约为___cfu的菌悬液；若为液体培养物，离心收集菌体，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释并制成每1mL含菌数约为___cfu的菌悬液。5黑曲霉菌菌悬液制备取黑曲霉的新鲜培养物加入适量含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，加入适量的含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含孢子数___cfu的孢子悬液。测定1mL菌悬液中所含的菌数。6保存菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。黑曲霉的孢子悬液可保存在2～8℃，在7天内使用。任务测评序号考核内容考核标准配分得分1培养基制备正确计算培养基各组分用量5

正确配制培养基10

能完成培养基灭菌操作5

培养基保存适宜5

2培养基适用性检查用菌液制备缓冲液或稀释液选择正确5

无菌操作规范标准10

移液器使用正确5

菌液保存适宜5

3抑菌效力测定用菌液制备缓冲液或稀释液选择正确5

无菌操作规范标准10

移液器使用正确5

1mL菌悬液中所含的菌数符合要求15

菌液保存适宜5

4培养物处理、无菌室清洁能正确完成培养物处理5

能正确完成无菌室清洁5

合计100项目一抑菌效力测定任务二金莲花口服液抑菌效力检查

任务引入请思考某制药企业生产了一批金莲花口服液，需要进行抑菌效力检查。如何判断抑菌剂的效力是否合格呢？

任务分析

抑菌效力检查主要环节包括培养基和试验菌菌液制备、方法适用性检查、供

试品接种、存活菌数测定、结果判断。1.抑菌效力检查法所用培养基和试验菌菌液制备已在本项目任务一中做了介绍，不再赘述。

2.方法适用性检查主要包括培养基适用性检查和存活菌计数方法的适用性检查。通过方法适用性检查确认抑菌效力检查法中所采用的培养基、计数方法适合于试验菌的生长和计数。

3.供试品接种和存活菌数测定是将一定量的试验菌接种到一定量的供试品中并贮存一段时间，在不同的贮存时间段中对供试品中的存活菌进行活菌计数。任务分析工作内容工作要求关键点培养基适用性检查与方法适用性试验供试组、对照组设置正确正确判断适用性供试品接种供试品抽样、接种操作正确正确抽样、无菌操作、无菌环境维持存活菌数测定取样时间、取样量正确无菌操作、无菌环境维持结果判断结果判断正确有效结果、供试品合格结果4.结果判断是将试验检查得到的存活菌数和标准菌数进行比较，判断供试品的抑菌效力是否达到标准。工作内容及要求相关知识-培养基适用性检查

培养基是影响微生物生长繁殖的重要因素，培养基可能由于其促生长能力、指示能力、抑制能力的差异，导致微生物菌落颜色形态、菌落数量等指标存在较大差异，从而影响结果判断的正确性。因此，培养基需要进行适用性检查，培养基适用性检查是通过比较试验菌在检验用培养基和对照培养基上生长的形态特征、数量等方面来评价检验培养基是否满足检验要求。抑菌效力测定用培养基包括成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基的适用性检查。相关知识-抑菌效力检查原理

抑菌效力检查是采用微生物法进行，供试药物制剂中含有的抑菌剂会对加入其中的微生物产生抑制作用，时间越长抑制作用越强，存活的微生物数量越少。

制备试验菌株新鲜培养物，然后再经过稀释制成浓度适宜的菌悬液或孢子悬液，按照一定的接种量接种于适量的供试药物制剂中，置于适宜温度下贮存，按照规定的时间间隔，分别从供试药物制剂中取样适量，接种于适合微生物生长的不同培养基中，以测定供试药物制剂中所含存活菌数。通过比较供试药物制剂在不同时间间隔中所含微生物数量的变化来判断供试药物制剂是否会对试验菌产生抑制作用而进行抑菌效力检查。任务实施一、制订工作计划根据任务要求，制定合理工作进度计划，并根据小组成员的特点进行分工。序号工作内容完成时间成员负责人1培养基适用性检查

2方法适用性试验

3供试品接种

4存活菌数测定

5结果判断任务实施二、试验前准备设备、器材、试剂规格数量用途无菌室

操作场所超净工作台

操作区域酒精灯

局部无菌环境75%酒精

擦拭消毒培养基各试剂

配制培养基移液器

移取定量液体试管、试管架

容器、支架三角瓶

盛放培养基细菌培养箱、真菌培养箱

培养灭菌锅

培养基灭菌供试菌株

制备供试菌菌液补充1：

补充2：

任务实施三、试验操作序号步骤操作内容1选器具超净工作台、恒温恒湿培养箱、无菌移液管、无菌培养皿等2取试剂胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、对照培养基3接种分别接种不大于____cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌的菌液至胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备____个平板，混匀，凝固；分别接种不大于____cfu的白色念珠菌、黑曲霉的菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备____个平板，混匀，凝固；用对应的对照培养基替代被检培养基进行上述操作4培养和计数金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌置____℃培养不超过____天，计数；白色念珠菌、黑曲霉置____℃培养不超过____天，计数5结果判断若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上菌落平均数的____%，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定培养基适用性检查用菌液制备：详见本项目任务一中“培养基适用性检查用菌液

制备”培养基适用性检查任务实施三、试验操作序号步骤操作内容1选器具超净工作台、恒温恒湿培养箱、无菌移液管等2取试剂胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、对照培养基3供试品接种取包装完整的供试品至少____份，直接接种试验菌，或取适量供试品分别转移至____个适宜的无菌容器中，若试验菌株数超过____株，应增加相应的供试品份数，每一容器接种一种试验菌，1g或1mL供试品中接菌量为____cfu，接种菌液的体积不得超过供试品体积的____%，充分混合，使供试品中的试验菌均匀分布，然后置____℃避光贮存。4存活菌数测定根据产品类型，分别从上述每个容器中取供试品____，测定每份供试品中所含的菌数。存活菌数测定方法及方法适用性试验照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105）”进行。根据存活菌数测定结果，计算____供试品各试验菌所加的菌数及各间隔时间的菌数，并换算成lg值。5结果判断见供试品抑菌效力评价标准抑菌效力测定用菌液制备：详见本项目任务一中“抑菌效力测定用菌液制备”抑菌效力测定任务实施

减少的lg值

6h24h7d14d28d细菌A23——NRB—13—NI真菌A——2—NIB———1NI注射剂、眼用制剂、用于子宫和乳腺的制剂抑菌效力判断标准注：NR表示试验菌未恢复生长。NI表示未增