常用分子生物学技术共127张

第四章常用分子生物学技术

ThePopularTechnologyinMolecularBiology:第1页，共127页。第一节

聚合酶链反应PolymeraseChainReaction第2页，共127页。

聚合酶链反应（PCR）技术是1983年由美国Cetus公司的KaryMullis建立的，是一种体外快速特异扩增已知序列的特定DNA片段的技术，能在数小时内将特定的DNA片段扩增100万倍。该技术的建立极大推动了生命科学的研究进展。KaryMullis由于发明了PCR技术获得1993年诺贝尔化学奖。一、PCR的基本原理PCR的基本原理类似于DNA的天然复制过程。是以拟扩增的DNA分子为模板，一对分别与模板5′端和3′端相互补的寡核苷酸为引物，以dNTP为原料，在适当缓冲液中，由热稳定DNA聚合酶催化，对一对寡核苷酸引物所界定的DNA片段进行扩增。第3页，共127页。基本反应步骤包括三步:

⑴变性（denaturation）通过加热至高于熔点温度的条件下（94~95℃，30秒~1分钟），使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA作为模板。

⑵退火（annealing）：将温度降低至适当温度（55℃，30秒）时，引物与DNA模板互补区结合，形成杂交链。由于模板分子结构较引物复杂的多，而且反应体系中引物的量大大多于模板DNA，使引物与其互补的DNA模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链间的互补机会较少；第4页，共127页。

（3）延伸（extension）将温度升至72℃，1.5分钟，DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列DNA为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，从而形成新的双链DNA。

以上三步为一个循环，每一循环的产物又可作为下一循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，如此重复循环，经过30个周期后，特定DNA片段的数量在理论上可增加109倍。第5页，共127页。

PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C第6页，共127页。5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

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TemplateDNA5

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一、基本工作原理目录第7页，共127页。Cycle35

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25～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。目录第8页，共127页。（3）两个引物之间尤其在3′末端不应有互补链存在，以免形成引物二聚体（dimerformation）。第56页，共127页。不易找到本底低的探针①耐高温，在70℃反应2h后，其残留活性大于原来的90%，在93℃反应2h后，其残留活性是原来60%，在95℃反应2h后，其残留活性是原来的40%。第75页，共127页。为了扩增出单一的、特异性的DNA片段，所设计的引物序列不能在模板序列中重复出现。①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。比较G、A+G、C+T、C各个泳道上放射自显影结果，读出测定的DNA序列。反义RNA的制备与导入细胞第84页，共127页。（2）水解反应，即磷酸二酯酶作用。因为用一般的聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶电泳方法对RNA进行鉴定时，由于RNA二级结构的影响，RNA并不严格按照其分子量大小分级。第75页，共127页。KaryMullis由于发明了PCR技术获得1993年诺贝尔化学奖。核酸分子杂交（Nucleicacidhybridization）是在DNA复性过程中，如果把不同来源的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。二、PCR体系

基本组成成分：模板DNA；特异性引物；耐热DNA聚合酶；dNTPs；Mg2+模板影响PCR效应主要有2方面因素。1.模板的纯度：单链、双链DNA以及通过反转录得到的cDNA都可以作为PCR反应模板。大多数用途的PCR反应，对DNA模板的要求不太严格。

但不能有核酸酶及蛋白水解酶等有害于PCR反应的物质存在。2.模板DNA的量：模板DNA的用量，是依DNA性质而定。对于质粒克隆的DNA，一般用纳克量ng；对于染色体DNA，一般要到微克级μg。（一）模板：第9页，共127页。（二）引物：PCR反应中引物的浓度一般为0.1~1.0μmol/L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，且可增加引物之间形成二聚体的几率，这两者还由于竞争使用酶、底物和模板，会使合成产率下降。PCR的效率和特异性取决于两个方面：一是引物与模板的特异结合，二是多聚酶对引物的有效延伸。由基因组DNA作为模板时，由于其数量的庞大及结构复杂，除了特异扩增外，往往很容易产生非特异性扩增产物。因此，引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。第10页，共127页。引物设计一般遵循的原则：

（1）引物长度以15～

30bp左右为宜。引物过短时会使特异性降低，过长时则成本增加，也会降低特异性。

（2）引物碱基种类尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物的G+C含量宜在45～

55%左右。

（3）两个引物之间尤其在3′末端不应有互补链存在，以免形成引物二聚体（dimerformation）。引物二聚体的形成不仅将导致PCR产物产量下降，还会引起引物比率失去平衡，从而导致非特异性DNA的合成（引物用量不对称的PCR叫做不对称PCR，其导致扩增失败的几率比标准PCR多得多）。第11页，共127页。

（4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分析。为了扩增出单一的、特异性的DNA片段，所设计的引物序列不能在模板序列中重复出现。这就是所谓的引物序列的独特性。

（5）引物5′末端碱基：引物设计时可以在5′末端加上限制性内切酶位点或其它短序列。第12页，共127页。

（6）引物3′末端碱基：原则上要求引物3′末端与模板DNA一定要配对。另外引物3′末端的末位碱基在很大程度上影响着TaqDNA聚合酶的延伸效率。引物3′末端碱基在错误配对时，不同碱基的引发链的合成效率存在很大差异。当末位碱基为A时，即使在错配的情况下，也能引发链的合成，而末位碱基是T时，错配时引发效率大大降低。G、C居于中间，所以3′末端的末位碱基最好选T、C、G，而不是A。第13页，共127页。（三）DNA聚合酶：在PCR反应中，DNA聚合酶是关键的因素之一。TaqDNA聚合酶是从一种嗜热水生菌ThermusaquaticusYT-1菌株中分离提纯的。TaqDNA聚合酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，其酶蛋白分子量为94kD。该酶在70~80℃时具有很高的生物学活性。合成速度150bp/秒.酶分子。90℃以上不变性。对Mg2+浓度非常敏感。第14页，共127页。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段的特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。①耐高温，在70℃反应2h后，其残留活性大于原来的90%，在93℃反应2h后，其残留活性是原来60%，在95℃反应2h后，其残留活性是原来的40%。TaqDNA聚合酶具有以下特点：第15页，共127页。

与大肠杆菌DNA聚合酶Ι相比，TaqDNA聚合酶缺乏3′→5′外切酶活性。因此，在PCR反应中如果发生某些单核苷酸的错配，这种酶是没有校正功能的。使用TaqDNA聚合酶的PCR反应出现碱基错配的机率为2.1×10-4左右。在100μL反应体系中，一般需要TaqDNA聚合酶的用量为0.5~5U。酶浓度的选择主要根据扩增片段的长短及其复杂程度不同而有所区别。使用酶浓度过高，可引起非特异产物的扩增，浓度过低则合成产物量减少。第16页，共127页。dNTP溶液具有较强的酸性，使用时应用NaOH将pH值调7.0-7.5，分装小管，于-20℃存放。dNTP浓度应在20～200μmol/L，浓度过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，浓度过低会导致反应速度的下降，但可提高实验的精确性。4种dNTP在使用时必须以等量浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率。如果其中一种dNTP浓度明显不同于其它几种时，就会诱发错误掺入，降低合成速率。此外，由于dNTP可能与Mg2+结合，因此应注意Mg2+浓度和dNTP浓度之间的关系。（四）底物（4种dNTP）第17页，共127页。（五）PCR反应的缓冲液：

在一般的PCR反应中，

Mg2+的合适浓度为，Mg2+过量能增加非特异性扩增并影响产率。PCR反应中使用10～50mmol/LTris.HCl调节pH，使TaqDNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。在反应体系中加入适量10%的二甲基亚砜，虽然对聚合酶活性有一定抑制作用，但可以减少模板二级结构，提高PCR反应特异性。第18页，共127页。1、变性：变性温度低时，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。三、PCR反应条件优化（一）循环参数：第19页，共127页。

2.退火：变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物与模板发生结合。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基的组成及其浓度，还有靶基因序列的长度。对于含20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，选择55℃为最适退火温度的起点较为理想。引物的合适复性温度可通过以下公式帮助选择

Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)

复性温度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物与模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。第20页，共127页。

3.延伸：TaqDNA聚合酶的生物学活性：

70～80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min足够；3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。但是对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。第21页，共127页。4.循环次数：循环次数决定PCR的扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。第22页，共127页。反应体系一般选用50~100μl体积，其中含有：

50mmol/LKCl10mmol/LTris.HCl（室温下pH=8.4）

1.5mmol/LMgCl2100μg/mL明胶或牛血清白蛋白（BSA）

2个引物，各0.25μmol/L4种底物（dATP+dCTP+dGTP+dTTP），各200μmol/L

模板DNA（人基因组DNA）0.1μgTaqDNA聚合酶2.5U第23页，共127页。

其中模板DNA的用量必须根据分子量的多少加以调整，一般需要含102～105拷贝的DNA，封上石蜡油防止高温反应时液体的挥发，即可进行PCR反应。PCR反应条件一般为：94℃变性30秒，55℃退火30秒，70~72℃延伸30~60秒，共进行30次左右的循环。在最后一个反应循环结束时，应该使PCR反应在72℃进一步延伸5分钟，以提高产物的扩增率。然后，将反应混合物冷却至4℃终止反应。

第24页，共127页。（二）PCR反应特点：1.特异性强：

决定PCR反应的特异性因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。

其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸都是遵循碱基配对原则。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。第25页，共127页。2.灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-2)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在细菌学中最小检出率为3个细菌。3、简便、快速：PCR反应利用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在PCR仪和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。第26页，共127页。

不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。4.对标本的纯度要求低：（三）PCR扩增产物的分析：PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。对PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。第27页，共127页。1.凝胶电泳分析：PCR产物电泳后，用EB溴乙锭染色后，在紫外仪下观察，可初步判断产物的特异性。2.酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段。此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。3.分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。4.核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。

第28页，共127页。（四）易出现的问题及解决方法:1.没有产物形成：①是否加入TaqDNA酶，酶活性如何？②DNA解链是否充分；③样品中可能有酶的抑制剂，用95℃加热10分钟将其失活；2.有非特异产物生成或产物在凝胶电泳中呈涂布状①减少循环周期；②增加退火温度、减少退火时间及延伸时间；③降低引物及TaqDNA酶浓度；④改变Mg2+浓度。3.假阳性结果的预防①PCR前、后所用的试剂器材分室存放，前后工序分室操作。②凡能耐高温的器材、试剂均经高压灭菌。③试剂防止污染。第29页，共127页。四、PCR的类型（一）反转录-PCR技术（RT-PCR）用途：克隆cDNA、检测RNA病毒、合成cDNA探针。

又叫做RNA-PCR技术，是将mRNA反转录与PCR技术相偶联的一种基因分离技术。通过mRNA反转录，得到与此mRNA相对应的cDNA，然后利用特定的PCR引物，直接以反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增反应，得到所需的基因。反转录可用总RNA或总poly（A）RNA为模板进行，反转录后不需要将单链cDNA合成双链cDNA。RT-PCR为经cDNA分离特定的基因提供了一种通用、快速的手段。第30页，共127页。（二）几种特殊的PCR1.锚定PCR（anchoredPCR）

通常采用的PCR反应必须知道欲扩增DNA或RNA片段两侧的序列，锚定PCR可以克服序列未知或序列未全知带来的障碍。锚定PCR是以mRNA反转录产生的cDNA为模板，利用带有特定限制性内切酶位点的锚定引物，从任何cDNA上得到直接用于克隆的cDNA片段。第31页，共127页。

分离细胞总RNA或mRNA，在反转录酶作用下合成cDNA，通过DNA末端转移酶在cDNA3′末端加上poly（dG）尾。与此pol（dG）相对应的锚定引物是poly（dC），为保证扩增的特异性，建议poly（dG）在12个碱基以上，5′端可带某些限制性内切酶序列。在与基因特异性配对的引物参与下，可以扩增此带同源多聚物尾巴的cDNA序列。过程：第32页，共127页。RNA模板逆转录酶DNA-RNA杂化双链RNA酶单链cDNA3′GG….GG5′末端核酸转移酶加poly(dG)尾3′GG….GGCC….CC5′CC…CCGG…GG3′5′扩增引物第33页，共127页。2.修饰PCR：在引物上加上若干额外序列，从而使产物的末端加上一段额外DNA序列，可以是酶切位点，也可以是突变位点.3.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份DNA样品中不同序列的PCR过程。由于每对引物扩增区位于模板DNA的不同部位，因而扩增片断长短不同，由此检测是否存在某些基因片段的缺失或突变。常用于某些遗传病的诊断。4.碱基替代PCR

利用PCR技术掺入某些碱基的修饰类似物。如当PCR扩增稳定的发夹结构区或高G+C含量的模板DNA时会很困难，此时可采用掺入C7dGTP(7-脱氧-2-脱氧鸟苷三磷酸)的方法，以降低产物的热稳定性，克服体外扩增的困难。第34页，共127页。

目标基因变性、复性5`5`3′3`acda3`端延伸bdKlenow聚合酶使用引物诱变的“左方”PCR使用引物诱变的“右方”PCR5.重组PCR:在研究基因的功能时，需要对基因进行点突变，包括碱基替代、缺失或插入等，以观察基因功能的改变。多种重组PCR方法可以引入突变，例如一步法PCR和重叠延伸法。第35页，共127页。

将组织固定，处理细胞内的DNA或RNA，以其为模板进行扩增的PCR反应称为原位PCR。原位PCR技术不仅不需要从组织细胞中分离出模板DNA，而且能在细胞原位进行PCR扩增，从而大大提高了检测的灵敏度。以组织切片或细胞悬液作为样品，经蛋白酶消化后，加入DNA酶降解DNA，还用生物素标记dNTP，在专用的原位PCR仪上进行，最后在显微镜下观察结果。原位PCR已成为研究靶基因序列的细胞定位、组织分布和靶基因表达检测的重要手段，广泛应用于肿瘤发生学、胚胎学和病毒学的研究。6.原位PCR（insituPCR）第36页，共127页。

不对称PCR是指在PCR扩增循环中所用的两个引物的浓度不同，从而得到单链DNA。典型的引物浓度比例是50：1或100：1。这样在最初PCR循环（15循环左右）中，绝大多数的PCR产物是双链并以指数式积累。但当低浓度的引物被消耗尽后，在进一步循环过程中，只有高浓度的引物介导PCR反应，产生大量单链DNA，以线性方式积累。利用不对称PCR可以产生特异性的单链DNA，用作DNA序列分析的模板等。7.不对称PCR（asymmetricPCR）第37页，共127页。8.定量PCR（multiplexPCR）

该方法是应用PCR技术检测标本中靶基因的拷贝数。将目的基因和一个单拷贝的参照基因置于同一个试管中进行PCR扩增，电泳后分成两条区带，比较两条区带的丰度，或在引物5′端标上标记物，通过检测区带的放射性强度或荧光强度，可测出目的基因的拷贝数。9.膜结合PCR：

将模板DNA用一定方法固定于硝酸纤维膜或尼龙膜上，再进行PCR。优点：模板可重复用，可纯化模板。缺点：扩增效率低。第38页，共127页。

着色互补PCR

又称为荧光PCR。就是将PCR的引物5′端用荧光物质标记而进行的PCR。其原理是用不同的荧光染料，如红色的罗丹明（POX）和绿色荧光素（FAM）等分别标记于不同的寡核苷酸引物上，同时扩增多个DNA区段，反应完毕后，利用分子筛除去多余的引物。用紫外线照射扩增产物，就能显示出某一种或几种荧光染料颜色的组合，如果某一DNA区段缺失，就会缺乏相应的颜色，据此可以很快诊断是否某种基因缺失，或是发现某些感染的病毒等。着色互补PCR可以进一步发展，为临床自动化诊断打下基础。10.着色互补PCR（colorcomplementationPCR）第39页，共127页。

反向PCR技术是对一个已知的DNA片段两侧的未知序列进行扩增研究。反向PCR方法有三个步骤：

⑴用限制性内切酶切割已知序列以外的DNA序列。

⑵被酶切后的DNA片段连接形成环状DNA分子。

⑶选择与已知序列DNA片段两末端序列相互补，并且3′端相互反向的引物进行PCR，这样可以有效扩增已知序列两侧的未知序列。用反向PCR可以对染色体DNA进行染色体步查（chromosemewalking）、扩增末端特异性的DNA片段、位点特异性突变等。11.反向PCR（InversePCR）第40页，共127页。已知序列未知序列限制酶切点（X)限制酶切点（X)限制酶（X)酶切连接PCR未知序列引物1引物2第41页，共127页。12.实时PCR

实时PCR是近年发展的一种核酸微量分析技术。

实时PCR的基本原理是引入了荧光标记分子，使得PCR反应中产生的荧光信号与PCR产物量成正比。因此，对每一反应时刻的荧光信号进行实时分析，从而计算出PCR的产物量。第42页，共127页。实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation第43页，共127页。SYBRGreen法优缺点

对DNA模板没有选择性

----适用于任何DNA

使用方便

-----不必设计复杂探针非常灵敏便宜优点

容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件对引物特异性要求较高缺点第44页，共127页。与目标序列互补实时荧光定量PCR方法2-------TaqMan法TaqMan---水解型杂交探针5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)

探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针第45页，共127页。TaqMan法工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光第46页，共127页。TaqMan法优缺点

对目标序列的高特异性

------阴性结果确定设计相对简单

------与目标序列某一区域互补重复性比较好优点

只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺点第47页，共127页。实时荧光定量PCR方法3-------Molecularbeacon法(分子信标)标记荧光的发夹探针环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素淬灭剂发夹型杂交探针第48页，共127页。Molecularbeacon(分子信标)应用范围

起始模板的定量基因型分析产物鉴定

SNP（单核苷酸多态性）分析第49页，共127页。Molecularbeacon(分子信标)优缺点高特异性：对目标序列检测SNP最灵敏的试剂之一荧光背景低优点

只能用于一个特定目标设计困难价格比较高缺点第50页，共127页。五、PCR的主要用途1.遗传性疾病的基因诊断

到目前为止已发现的遗传病有4000多种，以地中海贫血为例，主要是由基因缺失、插入、置换而造成的基因的不表达或表达水平低下。可以提取DNA，用PCR进行产前基因诊断。2.检测癌基因

目前已发现了大量的癌基因，其中ras基因是研究的最彻底的一种。PCR方法可以选择性扩增ras基因，大大提高了灵敏度，可以快速检测ras基因的点突变情况。第51页，共127页。3.PCR技术检测艾滋病

病毒性疾病的早期诊断对疾病的防治尤为重要。感染的早期，病毒仅侵入人体的少量细胞，PCR方法能从具有大量宿主核酸存在的条件下，特异性扩增病毒的核酸序列而加以检测。目前已经应用于艾滋病毒、乙肝病毒等疾病的诊断。4.PCR技术在分子生物学中的应用

PCR技术在分子生物学中的应用，除了疾病的基因诊断、病原体和癌基因的检测，还有DNA序列测定、基因的点突变、缺失或插入、基因克隆和表达等方面。第52页，共127页。5．在法医学上应用PCR技术在法医学应用主要是个人识别和亲子鉴定。最早在法医学的应用1985年，英国遗传学家从人基因文库中筛选出几种小的卫星DNA探针，从而制备除了具有个体特异性的限制性内切酶片段长度多态图谱（RFLP）称为DNA指纹（DNAfingerprint）。并成功用于个人识别和亲子鉴定。目前这项技术已在20多个国家使用。第53页，共127页。第二节

核酸分子杂交Nucleicacidhybridization第54页，共127页。一、基本原理

核酸分子杂交（Nucleicacidhybridization）是在DNA复性过程中，如果把不同来源的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。核酸分子杂交实质是双链DNA的变性和具有同源序列的两条单链的复性过程。第55页，共127页。DNA-DNA杂交双链分子变性复性不同来源的DNA分子第56页，共127页。第57页，共127页。复性RNADNA第58页，共127页。第59页，共127页。

探针(probe)：是一小段用同位素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸。将其与固定在NC（硝酸纤维素滤膜）膜上的核酸互补结合，可判断是否有同源的核酸分子存在。探针的选择与标记是杂交技术成功与否的关键。

杂交的双方是待测核酸序列及探针。待测核酸序列可以是基因组DNA,细胞总RNA或克隆的基因片段等。将标记的已知核酸片段作为探针(probe)，与待测样本核酸进行杂交反应，即可观察到样本核酸中相应的序列。二、探针的种类与标记第60页，共127页。1.基因组DNA探针：是指长度在几百个碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。是从基因组文库中筛选得到一个特定基因（或基因片段）的克隆后，大量扩增、纯化，切取插入片断，分离纯化，即可作为探针使用。基因组DNA探针含有内含子序列，但也可仅仅使用某一外显子序列作为探针，或仅仅使用某一内含子序列作为探针。（一）探针的种类

根据标记方法不同探针可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类；根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针，RNA探针，cDNA探针等几类，DNA探针还有单链和双链之分。第61页，共127页。①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。②DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移法，随机引物法，PCR标记法等，都能用于同位素和非同位素标记。DNA探针（包括cDNA探针）的主要优点：2.cDNA探针：利用mRNA反转录合cDNA后，经PCR扩增可制备大量cDNA探针。也可将cDNA克隆于适当的克隆载体，通过扩增重组质粒而使cDNA大量扩增。提取质粒，用限制性内切酶消化，将cDNA片断切割下来，分离纯化，即可作探针使用。第62页，共127页。3.RNA探针：可从细胞中直接提取mRNA或利用DNA合成仪合成小片段的RNA作为探针。由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高。因此，RNA探针具有DNA探针所不能比拟的高杂交效率，但RNA探针也存在易于降解和标记方法复杂等缺点。

4.人工合成寡核苷酸探针：人工设计，在DNA合成仪上合成。人工合成的寡核苷酸探针具有一些独特的优点：①由于链短，其序列复杂程度低，分子量小，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短②可识别靶序列内1个碱基的变化，因为短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的Tm值。③可一次大量合成（1～10mg），使得这种探针价格低廉。

第63页，共127页。

核酸探针的制备是分子杂交技术的关键。最早采用的也是目前最常用的核酸探针标记方法是放射性同位素标记。常用的放射性同位素有32P和35S，前者能量高，信号强，最常用。放射性同位素标记探针虽然敏感度高，但却存在辐射危害和半衰期的限制（32P半衰期为14.3天，35S半衰期为87.1天，125I的半衰期为60天），3H的半衰期长达12.3年，但它释放β射线能量太低（0.018Mev），只能用于组织原位杂交。

（二）探针的标记方法第64页，共127页。

1.

放射性核素的标记（1）切口平移法：

该技术由Kelly等于1970年创立。是目前最常用的一种脱氧核糖核酸的探针标记法。是利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的多种酶促活性将标记的dNTP掺入到新形成的DNA链中去，从而合成高比活的均匀标记的DNA探针。线状、超螺旋及带缺口的双链DNA匀可作为模板。第65页，共127页。

如果在反应液中含有一种或多种标记的核苷酸（如32P—dCTP），则这些标记的核苷酸将替代原来的核苷酸残基，从而形成高放射性活性的DNA探针。

首先，用极微量的DNaseⅠ在Mg2+的存在下，在DNA链上随机形成单链切口。利用大肠杆菌DNA聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性在切口处将从旧链5′—末端逐步切除。同时，在DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′聚合酶活性的催化下，以互补的DNA单链模板，顺序将同位素标记的dNTP连接到切口的3′末端—OH上，合成新的DNA单链。第66页，共127页。5′3′3′5′DNA酶ⅠMg2+DNA聚合酶Ⅰ[α-32P]-dNTP双链DNA带切口的双链DNA32P部分标记的单链DNA片断变性5′3′3′5′5′5′3′3′第67页，共127页。（2）随机引物法(randompriming)

随机引物是人工合成的长度为6个核苷酸的寡聚核苷酸片段的混合物，它们的顺序是根据计算机分析了生物基因组DNA六核苷酸排列的多种可能性而设计的。这些随机引物可以随机的结合到任意一个用作探针的DNA片断上，起到DNA合成引物的作用。将这些随机引物与变性后的DNA单链结合，以此随机引物为引物，变性后的DNA单链为模板，在Klenow片段的催化下，4种dNTP（其中一种为标记物标记的dNTP）为原料，合成与探针DNA互补的带有标记物的DNA探针。第68页，共127页。5’3’3’5’5’3’5’3’变性Klenow聚合酶；[32P]-dCTP;dNTP随机引物变性标记探针第69页，共127页。

（3）末端标记法：该法需要DNA分子末端带有羟基。如果要标记的DNA分子的5′端为磷酸基团，必须用碱性磷酸酶催化切除5′末端的磷酸基团，然后才能标记。其原理是利用多核苷酸激酶将[r

-32P]ATP分子上r位磷酸基转移至寡核苷酸链的5′末端，也可在3′端标记。2.

非放射性的标记法

按标记方法不同，可分为两类：一类是将标记物预先连接在NTP或dNTP上，与放射性核素标记的核苷酸一样用酶促聚合方法掺入到核酸探针上，如生物素、地高辛等。另一类是直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上，即化学标记法。第70页，共127页。

（1）生物素标记探针：生物素标记的脱氧核苷三磷酸有：dUTP、dATP、dCTP等，生物素可与dUTP、dATP、dCTP共价结合，在DNA聚合酶的作用下，标记的dUTP可代替dTTP，标记的dATP可代替dATP，标记的dCTP代替dCTP掺入到DNA探针中。生物素探针的监测系统主要有抗生物素蛋白和链亲和素，它们被标上了过氧化物酶或碱性磷酸酶。当掺入探针DNA分子中的生物素与抗生物素蛋白或链亲和素特异结合时，标在上面的酶就可催化底物发生颜色变化，从而指示探针所在位置。可用于外源基因的检测。

第71页，共127页。

（2）地高辛标记核酸探针：地高辛是一种固醇类的半抗原，通过不稳定的酯键连接到dUTP上。用地高辛标记过的dUTP可代替dTTP掺入DNA探针，可用酶或荧光色素结合的地高辛配基抗体直接检测，或间接使用免疫荧光法进行检测。

（3）辣根过氧化物酶(HRP)标记探针：将HRP与聚乙烯亚胺结合，然后与DNA结合，产生酶标记的探针，与靶基因杂交后，利用酶促反应使底物显色即可指示探针位置。第72页，共127页。

液相杂交：是将变性的待测核酸单链与标记的探针在溶液中保温，使之形成杂交复合物。反应结束后，用羟磷灰石法或酶解法将未被杂交的单链和杂交双链分开，然后计算杂交分子中的探针量，就可推算出被测的核酸量。三、核酸分子杂交技术类型：液相杂交和固相杂交。

固相杂交：（solid-phasehybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。第73页，共127页。

印迹方法：

1)可直接将核酸样品点样于固相支持物上，称为斑点技术及狭缝印迹杂交(dot/blothybridization);2)毛细管转移。本方法由Southern发明,故又称为Southern转移(或印迹)。毛细管转移法的优点是简单,不需要用其它仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信号较弱。

3)电转移法：利用电场作用转移。

4)真空转移法：利用真空抽滤作用转移。第74页，共127页。（一）Southern转移印迹杂交法

中和第75页，共127页。分子杂交实验①②③目录第76页，共127页。

原理：将电泳分离的RNA片段转移到一定的固相支持物上，从而用于杂交反应以鉴定其中特定的mRNA分子量的大小。（二）Northern杂交

基本操作流程：⑴RNA变性电泳；⑵RNA转膜；⑶转膜后的RNA片段与标记的探针杂交三个步骤。第77页，共127页。

因为用一般的聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶电泳方法对RNA进行鉴定时，由于RNA二级结构的影响，RNA并不严格按照其分子量大小分级。但采用RNA变性电泳处理后，二级结构解体，泳动时便能严格按照其分子量大小分级。为什么要用RNA变性电泳？

常见的RNA变性电泳有聚乙二醛和二甲基亚砜变性电泳、甲醛变性电泳、甲基氢氧化汞电泳等。

被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。第78页，共127页。但是在一反应体系中除了存在四种dNTP以外，再加入2′和3′双脱氧的脱氧核苷三磷酸（2′,3′ddNTP）。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。②天然存在的核酶，根据构象分为锤头状、发夹状、斧头状。第105页，共127页。PCR反应条件一般为：94℃变性30秒，55℃退火30秒，70~72℃延伸30~60秒，共进行30次左右的循环。以上三步为一个循环，每一循环的产物又可作为下一循环的模板。不易找到本底低的探针一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。但不能有核酸酶及蛋白水解酶等有害于PCR反应的物质存在。对于未知DNA序列的测定，是要确定一个未知序列的准确长度和核苷酸的排列顺序。三种印迹技术的比较第79页，共127页。放射自显影照片目录第80页，共127页。

斑点杂交是指将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上,然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。同一种样品经不同倍数的稀释,还可以得到半定量的结果。（三）斑点杂交

优点：简便、快速、经济。缺点：目的序列与非目的序列未分离,因此，不能了解目的序列的长度。尤其当本底干扰较高时,难以区分目的序列信号和干扰信号。第81页，共127页。

原位杂交的基本流程:组织细胞的固定→预杂交→杂交→冲洗→放射自显影或免疫酶法显示。

1.细胞内原位杂交：在载玻片上的细胞内进行。经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在细胞内的空间位置。例如：对致密染色体DNA的原位杂交可用于显示特定序列的位置；与细胞内RNA的杂交可精确分析任何一种RNA在细胞中和组织中的分布。（四）原位杂交第82页，共127页。

⑴能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究，而不受同一组织中其它成分的影响。⑵由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性。⑶可以完整地保持组织与细胞的形态，更能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态。2.菌落原位杂交：原位杂交的优点：第83页，共127页。第84页，共127页。第三节核酸序列分析NucleicAcidSequenceAnalysis第85页，共127页。DNA序列分析技术是分子生物学中一项极为重要的技术，DNA序列分析技术现在已经从手工操作发展到自动分析。一、原理：

1.利用复制终止法或化学断裂等方法，产生具有不同长度的DNA片段，其长度之间的最小差异是一个碱基，且被特定的标记化合物标记，便于检测。

2.用变性的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，变性胶的分辨率为一个碱基。

3.对完成的测序胶进行放射自显影、银染或在自动测序仪上通过自动记录标记在不同碱基上的不同荧光信号读取DNA的序列。第86页，共127页。

目前DNA测序的具体方法很多，但其原理都是来源于两个基本的方法，即1977年Sanger发明的双脱氧链终止法（一般称为酶法）及由Maxam和Gilbert在1977年发明的化学降解法。由于Sanger的测序技术操作比较简单，目前绝大多数实验室采用该法，而DNA序列自动分析也是以Sanger测序法为基础发展起来的。二、常用测序方法第87页，共127页。1.双脱氧链终止测序法的原理：

在有DNA模板、引物和4种dNTP及合适的缓冲液存在下，DNA聚合酶可以从引物的3′端开始按模板链的碱基排列顺序，根据碱基配对的原则延伸合成复制链。但是在一反应体系中除了存在四种dNTP以外，再加入2′和3′双脱氧的脱氧核苷三磷酸（2′,3′ddNTP）。（一）双脱氧链终止测序法

第88页，共127页。

由于2′,3′ddNTP与普通dNTP不同之处在于其脱氧核糖的3′位置缺少一个羟基。它们虽然可以在DNA聚合酶作用下通过其5′三磷酸基团掺入到正在延长的DNA链中，但由于没有脱氧核糖的3′羟基，不能与后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在复制的DNA链不能再延伸。这样，链延伸将由于2′,3′双脱氧核苷三磷酸的掺入随即终止。第89页，共127页。

在测序反应中，通常设置四组独立的反应体系，在每个反应体系中，都加入DNA模板、引物、DNA聚合酶Ⅰ、dNTP，其中一种带有32P或35S放射性标记。另加入四种双脱氧核苷酸（ddATP、ddGTPddCTPddTTP）中的一种。由于ddNTP的参与，结果将产生四组核苷酸片段，分别随机终止于模板链的A、C、G、T。然后将四组反应混合物，按A、C、G、T的顺序分别加入到变性聚丙烯酰胺凝胶的样品槽中进行高压电泳，最后，通过放射自显影等方法直接读出DNA上的核苷酸序列。第90页，共127页。

2.基本过程：①制备单链模板；②在4只试管中逐个加入适当的模板、DNA聚合酶Ⅰ、带3´-OH的引物和4种dNTP（其中一种带放射性标记）及4种不同的ddNTP，③经反应合成各种随机长度的产物；

④各反应体系在不同的泳道上电泳，⑤经放射自显影可得出直读图。由于在4组独立的酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每一个A、每一个G或每一个T、C的位置上。第91页，共127页。第92页，共127页。目录第93页，共127页。

化学降解法是1977年由Maxam和Gilbert创建的以化学修饰为基础的DNA序列分析法。

1.基本原理：用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片断，造成碱基的特异性切割，由此产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳按大小分离后，经放射自显影即可在X胶片上显示相应的带谱，可直接读出DNA链的序列。（二）化学降解法第94页，共127页。DNA化学裂解反应体系反应体系碱基修饰试剂碱基修饰反应主链断裂试剂断裂点G硫酸二甲酯鸟嘌呤甲基化六氢吡啶GG+A甲酸脱嘌呤作用六氢吡啶G和AC+T肼嘧啶开环六氢吡啶C和TC肼（加盐）胞嘧啶开环六氢吡啶C

化学法测序的基础是碱基特异性的裂解反应，包括三个步骤：①对特定的碱基（或特定类型碱基）进行化学修饰；②碱基消除；③用特定试剂使修饰碱基从糖环上脱落下来，修饰碱基的5’和3’磷酸二酯键断裂。第95页，共127页。

化学法的特异性修饰

碱基特异的修饰方法

G在pH8.0下,用硫酸二甲酯对N7进行甲基化，使

C8-C9键被碱裂解。

A+G在pH2.0下,哌啶甲酸可以使嘌呤环的N原子质子化,导致脱嘌呤,削弱A、G的糖苷键

C+T肼使嘧啶环开环，并重新形成五元环，后者不稳定，易被剔除。

C在一定NaCl浓度存在下，肼只对胞嘧啶起作用。

在每种情况下，这些反应要控制在确保每个DNA分子平均只有一个靶碱基被修饰，其后用哌啶裂解修饰碱基的3’和5’位置，得到一组长度从1至数百个核苷酸不等的末端标记分子。比较G、A+G、C+T、C各个泳道上放射自显影结果，读出测定的DNA序列。第96页，共127页。①标记目的DNA片段的一端；②将标记DNA分成4份，用不同化学试剂进行4种特定裂解反应，每种反应只断裂某一种或某一类碱基，控制反应程度，使得平均每个DNA分子只有一个位置被随机降解，从而使4种反应体系中分别产生一组起始于标记末端,终止于某一种或某一类碱基的不同长度的DNA片段；2.测序的基本过程：③将4种反应体系的降解产物在不同泳道上同时电泳，经放射自显影即可读出DNA序列。第97页，共127页。5´-GATCACTACTG-3´5´-﹡GATCACTACTG-3´5´-﹡GATCACTACTG5´-﹡GATCACTACTG5´-﹡GATCACTACT5´-﹡GATCACTAC5´-﹡G5´-﹡GATCACTA5´-﹡GATCACTAC5´-﹡GATCAC5´-﹡GATCA5´-﹡GATCACT5´-﹡GATC5´-﹡GA5´-﹡GATCAC5´-﹡G5´-﹡GATC5´-﹡GATGG+A硫酸二甲酯甲酸肼C+TC肼加盐第98页，共127页。5´-﹡GATCACTACTG5´-﹡GATCACTACT5´-﹡GATCACTAC5´-﹡GATCACTA5´-﹡GATCACT5´-﹡GATCAC5´-﹡GATCA5´-﹡GATC5´-﹡GAT5´-﹡GA5´-﹡GGATC++GC5′3′第99页，共127页。

将目的DNA片段纯化后，随机断裂并亚克隆，随机收集亚克隆然后测序，既不需努力确定这些亚克隆在靶DNA中的位置，也不必设法查明究竟测出的是哪一条链的序列，只要把积累资料贮存起来，最后用计算机处理从而获得整个DNA序列。（三）随机法（或鸟枪测序法）

根据上一组测序的反应获得的核苷酸序列，再设计新的寡核苷酸作为下一组反应的引物，逐步向前推进，最终则测得目的DNA的全部序列。（四）引物延伸法第100页，共127页。三、DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激发光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。A1.LFexpressTM全自动激光荧光核酸测序仪ALFexpressTM全自动激光荧光核酸测序仪是由德国海德堡欧洲分子生物学实验室WilhelmAnsorge和BrianSproat设计的。该仪器设计独特，提供快速可靠的测序和片段分析，在人类基因组大规模测序中起到了重要的初筛作用。第101页，共127页。

.ABI最新型全自动DNA测序仪在1987年PE（PerkinElmer）公司推出自动DNA测序仪，其专利是分别采用4种不同荧光染料进行标记而在同一个泳道测序，具有很大优越性测序策略多数情况下，测序是对已知序列的亚克隆进行鉴定，只需直接克隆到M13或质粒载体中进行测序。对一个较大片段DNA的鉴定，可利用通用引物分别从两端开始双向测序，再通过中间重叠部分拼出全序列。对于未知DNA序列的测定，是要确定一个未知序列的准确长度和核苷酸的排列顺序。对较小的DNA片段（小于400bp），可以直接克隆到M13或质粒载体中进行测序。如果是数千个碱基的DNA大片段，就要将其切割成适当大小的片段，再进行克隆测序。第102页，共127页。DNA自动测序结果举例目录第103页，共127页。第四节

生物芯片技术BiologicalChipTechnique第104页，共127页。生物芯片技术基因芯片（DNA芯片）蛋白质芯片细胞芯片组织芯片其它芯片（如样品制备芯片、核酸扩增芯片等）

生物芯片技术是在20世纪发展起来的一项新的规模化生物信息分析技术。已被应用于生命科学的众多领域，包括：基因表达检测、基因突变检测、基因诊断、功能基因组研究、基因组作图和新基因发现等多个方面。生物芯片的种类：第105页，共127页。是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNAmicroarray)。一、基因芯片基因芯片(genechip)第106页，共127页。基因芯片的特点

基因芯片可在同一时间内分析大量的基因，高密度基因芯片可以在1cm2面积内排列20000个基因用于分析，从而实现了基因信息的大规模检测。第107页，共127页。基因芯片的应用基因芯片特别适用于分析不同组织细胞或同一细胞不同状态下的基因差异表达情况，其基本原理是基于双色荧光探针杂交。该系统是将两个不同来源样品的mRNA经反转录合成cDNA时，用不同荧光分子（如正常用红色，肿瘤用绿色）进行标记。两种不同荧光分子标记的cDNA等量混合后与基因芯片进行杂交，在两组不同的荧光下检测，获得两个不同样品在芯片上的全部杂交信号。呈现绿色荧光的位点代表该基因只在肿瘤组织表达，呈现红色信号的位点代表该基因只在正常组织表达，呈现两种荧光互补色—黄色的位点表明该基因在两种组织中均有表达。第108页，共127页。基因芯片工作流程示意图第109页，共127页。是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片蛋白质芯片(proteinchip)第110页，共127页。蛋白质芯片作用原理是蛋白质分子间的亲和反应，例如抗原-抗体或受体-配体之间的特异性结合。最常用的探针蛋白是抗体。在用蛋白质芯片检测时，首先要将样品中的蛋白质标记上荧光分子；标记的蛋白质一旦结合到芯片上就会产生特定的信号；通过激光扫描系统检测信号即可对蛋白质进行定性或定量分析。第111页，共127页。蛋白质芯片的特点及应用特点：蛋白质芯片技术具有快速和高通量等特点，它可以对整个基因组水平的上千种蛋白质同时进行分析，是蛋白质组学研究的重要手段之一。应用：蛋白质芯片技术已广泛应用于蛋白质表达谱、蛋白质功能和蛋白质间的相互作用的研究。在临床疾病的诊断和新药开发的筛选上也有很大的应用潜力。第112页，共127页。第五节

反义核酸技术第113页，共127页。

一、基本原理：反义核酸技术是指人工合成或生物合成的DNA或RNA，能与mRNA互补，是抑制与疾病发生相关的基因表达的一种手段，它能封闭基因表达，具有特异性且操作简单，可用于治疗由于基因突变或过度表达所致的肿瘤和遗传疾病。

其简单的原理是：根据碱基互补配对的原则设计出能够与靶基因特异结合RNA或DNA序列，以其影响靶基因表达，抑制其功能。第114页，共127页。

根据核酸种类和作用方式的不同，反义技术主要分为反义RNA、反义DNA、核酶（ribozyme）三类