T-ZNZ 291-2024 饲料中多种抗球虫类药物的测定 液相色谱-串联质谱法

CCSB46T/ZNZ浙江省农产品质量安全学会发布IT/ZNZ291—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。本文件起草单位：绿城农科检测技术有限公司。本文件主要起草人：余鹏飞、董叶箐、傅诗敏、沈雄雅、陈蓉、何誉、倪娟桢、林婷、孙文闪、何晓明、徐伟荣。1T/ZNZ291—2024饲料中多种抗球虫类药物的测定液相色谱-串联质谱法本文件规定了饲料中16种抗球虫类药物的液相色谱-串联质谱测定方法。本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和预混合饲料等4类饲料中氨丙啉、常山酮、地克珠利、二硝托胺、癸氧喹酯、甲苄喹啉、甲基盐霉素、克拉珠利、氯苯胍、氯羟吡啶、拉沙洛西、马度米星铵、莫能菌素、尼卡巴嗪标志物、盐霉素、乙氧酰胺苯甲酯的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理试样中抗球虫类药物经乙腈水溶液提取，用通过型亲水亲脂平衡型固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱定性定量测定，基质外标法定量。5试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为色谱纯，水为GB/T6682规定的一级水。5.1试剂和材料5.1.1乙腈（CH3CN）。5.1.2甲醇（CH3OH）。5.1.3N,N-二甲基甲酰胺。5.1.4乙酸铵（HCOONH4）。5.2试剂配制5.2.180%乙腈水溶液：取乙腈800mL、水200mL，混匀。2T/ZNZ291—20245.2.20.005mol/L乙酸铵水溶液：取乙酸铵0.385g，用水溶解并稀释至1000mL。5.3标准品氨丙啉、常山酮、地克珠利、二硝托胺、癸氧喹酯、甲苄喹啉、甲基盐霉素、克拉珠利、氯苯胍、氯羟吡啶、拉沙洛西、马度米星铵、莫能菌素、尼卡巴嗪标志物、盐霉素、乙氧酰胺苯甲酯含量≥95.0%，或均应为有证标准物质，具体见附录A。5.4标准溶液配制5.4.1标准储备溶液（1000mg/L）：分别准确称取适量16种抗球虫类药物标准品（相当于有效成分10mg，精确至0.01mg），用N,N-二甲基甲酰胺3mL溶解后，再用甲醇定容至10mL，此溶液浓度均为1000mg/L。-18℃避光密封保存，有效期6个月。5.4.2混合标准工作液：准确量取标准储备液（5.4.1）氨丙啉、癸氧喹酯、甲卞喹啉各0.1mL，常山酮、甲基盐霉素、拉沙洛西、氯苯胍、马度米星铵、莫能菌素、盐霉素、地克珠利、尼卡巴嗪标志物各0.5mL，氯羟吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、克拉珠利、二硝托胺各2mL于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成混合标准工作液。其中氨丙啉、癸氧喹酯、甲卞喹啉浓度为1mg/L，常山酮、甲基盐霉素、拉沙洛西、氯苯胍、马度米星铵、莫能菌素、盐霉素、地克珠利、尼卡巴嗪标志物浓度为5mg/L，氯羟吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、克拉珠利、二硝托胺浓度为20mg/L。-18℃避光密封保存，有效期1个月。5.5材料5.5.1通过型亲水亲脂平衡型固相萃取柱：200mg，6mL。5.5.2聚四氟乙烯微孔滤膜：0.22μm。6仪器和设备6.1液相色谱—串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。6.2分析天平：感量0.01mg和1mg。6.3离心机：≥4000r/min。6.4涡旋振荡器。6.5超声波清洗器。6.6固相萃取装置。7试样的制备与保存7.1试样的制备按GB/T14699.1的规定抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样，按照GB/T20195制备试样，粉碎后过0.45mm孔径的分析筛，混匀，装入磨口瓶中，备用。a)取粉碎过筛后的供试样品，作为供试试料。b)取粉碎过筛后的空白样品，作为空白试料。c)取粉碎过筛后的空白样品，添加适宜浓度的混合标准工作液,作为空白添加试料。3T/ZNZ291—20247.2试样的保存将样品置于阴凉、避光处保存。8测定步骤8.1提取称取2g（精确至0.001g）试样于50mL离心管中，准确加入10mL80%乙腈水溶液（5.2.1）涡旋混匀5min后，超声提取20min，4000r/min离心5min，取上清液于50mL离心管中；残渣用10mL80%乙腈水溶液（5.2.1）重复提取一次，合并上清液，备用。8.2净化移取1mL备用液过固相萃取柱，弃去，再移取2mL备用液过柱，收集滤液，过滤膜，供液相色谱—串联质谱仪测定。8.3基质匹配标准曲线的制备取6份空白样品经提取和净化后，加入适量的混合标准工作液（5.4.2）配制成氨丙啉、甲卞喹啉、癸氧喹酯浓度为0.0005mg/L、0.001mg/L、0.005mg/L、0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L；常山酮、甲基盐霉素、拉沙洛西、氯苯胍、马度米星铵、莫能菌素、盐霉素、地克珠利、尼卡巴嗪标志物浓度为0.0025mg/L、0.005mg/L、0.025mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.25mg/L；氯羟吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、克拉珠利、二硝托胺浓度为0.01mg/L、0.02mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、1mg/L的基质匹配标准溶液，供液相色谱—串联质谱测定。以测得特征离子峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为橫坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。8.4测定8.4.1液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a)色谱柱：T3柱（50mm×2.1mm，1.8μm），或相当者。b)流动相：A为0.005mol/L乙酸铵水溶液（5.2.2），B为甲醇。c)梯度洗脱：洗脱程序见表1。d)流速：0.35mL/min。e)柱温：40℃。f)进样量：2μL。表1梯度洗脱程序时间，min09550.59552.55955.55955.519558.59554T/ZNZ291—20248.4.2质谱参考条件质谱参考条件如下：a)离子源：电喷雾（ESI）离子源。b)扫描方式：正/负离子扫描。c)检测方式：多反应监测。d)接口温度：350℃。e)脱溶剂温度：602℃。f)加热块温度：400℃。g)雾化气流量：3L/min。h)加热气流量：10L/min。i)干燥气流量：10L/min。j)其他质谱参数参考值见表A.2。8.4.3定性测定在同样测试条件下，试样中待测药物的保留时间与基质匹配标准工作液中待测药物的保留时间之比，偏差在±2.5%以内，且检测到的相对离子丰度，应当与浓度相当的基质匹配标准溶液相对离子丰度一致。其允许偏差应符合表3的要求。表3定性确证时相对离子丰度的允许偏差>50>20-50>10-208.4.4定量测定取试样溶液和基质匹配标准工作液，作单点或多点校准，按外标法定量，基质匹配标准工作液及试料溶液中目标物的响应值均应在仪器检测的线性范围内，如超过线性范围，应重新实验或将试样溶液和基质匹配标准溶液作相应稀释f倍后重新测定。单点校准定量时，试样溶液中待测物的浓度与标准溶液浓度相差不超过30%。在上述色谱质谱条件下标准溶液特征离子质量色谱图见附录B。8.4.5空白试验取空白试样，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。9结果计算和表述试样中抗球虫药物的量标准曲线校准按（1）计算或单点校准按（2）计算，结果保留3位有效数字。式中：X——试样中被测物质的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；C——由标准曲线得到的试样溶液中相对应被测物质浓度，单位为毫克每升（mg/LV——提取液体积的数值，单位为毫升（mL）；m——试料质量的数值，单位为克（g1000——换算系数；f——上机测定的试样溶液浓度超出线性范围后，进一步稀释的倍数。5T/ZNZ291—2024式中：X——试样中被测物质的含量，单位为毫克每千克（mg/kgA——试样中被测物质的峰面积；Cs——基质匹配标准溶液中被测物质浓度的数值，单位为毫克每升（mg/LV——提取液体积的数值，单位为毫升（mL）；As——基质匹配标准溶液中被测物质的峰面积；m——试料质量的数值，单位为克（g1000——换算系数；f——上机测定的试样溶液浓度超出校准点30%，进一步稀释的倍数。10方法灵敏度、准确度和精密度10.1灵敏度本方法氨丙啉、甲卞喹啉、癸氧喹酯的定量限为0.01mg/kg；常山酮、甲基盐霉素、拉沙洛西、氯苯胍、马度米星铵、莫能菌素、盐霉素、地克珠利、尼卡巴嗪标志物定量限为0.05mg/kg；氯羟吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、克拉珠利、二硝托胺的定量限为0.2mg/kg。10.2准确度本方法氨丙啉、甲卞喹啉、癸氧喹酯在0.01mg/kg~0.25mg/kg，常山酮、甲基盐霉素、拉沙洛西、氯苯胍、马度米星铵、莫能菌素、盐霉素、地克珠利、尼卡巴嗪标志物在0.05mg/kg~1.25mg/kg，氯羟吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、克拉珠利、二硝托胺在0.2mg/kg~5mg/kg添加浓度水平上的回收率为70%~120%。10.3精密度本方法批内相对标准偏差≤15%，批间相对偏差≤15%。6T/ZNZ291—2024（资料性）16种抗球虫药物的中英文名称、CAS号、分子式、相对分子量及定性、定量和质谱分析参数16种抗球虫药物的中英文名称、CAS号、分子式、相对分子量见表A.1。表A.116种抗球虫药物的中英文名称、CAS号、分子式、相对分子量1C14H19ClN42C16H17BrClN3O33C17H9Cl3N4O24C8H7N3O55C24H35NO56NequinateC22H23NO47NarasinC43H72O118C17H10Cl2N4O29C15H13Cl2N5·HClC7H7Cl2NOC34H53NaO8C47H83NO17C36H61O11·Na尼卡巴嗪标志物（4,4'-二C13H10N4O5C42H69NaO11C12H15NO47T/ZNZ291—202416种抗球虫药物的定性、定量和质谱分析参数见表A.2