生物化学 第三节 蛋白质的分子结构

第三节

蛋白质的分子结构(P66)

蛋白质是复杂的大分子，其结构复杂，具有三维空间结构。根据蛋白质肽链折叠的方式与复杂的程度将蛋白质的分子结构分为四级，即一级结构和空间结构（包括二，三，四级结构）。

一.蛋白质的一级结构

（primarystructure）

蛋白质的一级结构又称共价结构或者基本结构，蛋白质是由氨基酸组成的高分子有机化合物（前面讲过蛋白质的基本组成单位是氨基酸），不同的蛋白质的氨基酸的种类、数量和排列顺序不相同，导致了蛋白质结构的复杂性和生物学功能的多样性。正是因为氨基酸的种类、数量和排列顺序不相同导致了蛋白质结构的复杂性和生物学功能的多样性，所以蛋白质的一级结构要讨论的中心问题是：1)

蛋白质分子中氨基酸之间是怎样连接的?2)

每种蛋白质是否有确定的氨基酸排列顺序?(一)、肽链和肽键

peptidechainandpeptidebond

肽键（peptidebond）：是蛋白质分子中基本的化学键，是由一分子氨基酸的α-羧基与另一分子氨基酸的α-氨基缩合脱水而成的。现在公认蛋白质分子中氨基酸连接的基本方式是肽键，这主要有下列实验证据：第一，蛋白质分子中游离的α-氨基和α-羧基很少，但在蛋白质水解过程中游离的

α-氨基和α-羧基以等摩尔数的数值增加，这表明氨基酸中α-氨基和α-羧基在构成蛋白质时，参与某种结合；而当蛋白质水解时，这种结合又断开，从而形成新的α-氨基和α-羧基。第二，某种人工合成的多肽能被蛋白酶水解，更进一步还发现，同样这些蛋白酶不但能水解肽键，而且能催化其逆反应，即在氨基酸和多肽之间形成肽键。第三，包含肽键结构的化合物如双缩脲（biuret）

H2N-CO-HN-CO-NH2能与天然硫酸铜-氢氧化钠溶液产生双缩脲颜色反应，天然蛋白质也有同样的反应。-----蛋白质显色和定量。第四，人工合成的多聚氨基酸的X射线衍射图案和红外吸收光谱与天然的纤维状蛋白质十分相似。第五，我国在世界上首次人工合成蛋白质----结晶牛胰岛素的成功，完全证明了蛋白质肽链结构学说的正确性。

所以，蛋白质分子是由氨基酸组成的，氨基酸彼此直接通过肽键相连。

那么肽及肽链的概念又是怎么样的呢?

肽：指氨基酸通过肽键相连而成的化合物。由两个氨基酸组成的肽称为二肽，三个氨基酸组成的肽称为三肽。依此类推，一般地把十个氨基酸以下组成的肽称为寡肽（oligopeptide），十个氨基酸以上组成的肽称为多肽或者多肽链（polypeptide）其结构为：

规则(P67)1）、书写格式从N到C。

2）、蛋白质和肽的命名从N到C。

3）、体内多肽或蛋白质合成的过程从N到C。举例：Ala-Gly-Ser，Ser-Gly-Ala;

Gly-Ser-Ala，Ser-Ala-Gly

同是三种氨基酸组成的三肽，但若排列顺序不同，则组成不同的三肽。所以20种氨基酸可以构成许多种蛋白质。

4)

、主链与侧链上述重复内容：1)蛋白质N含量：16%2)氨基酸结构特点3)氨基酸分类4)氨基酸分类与分析要求掌握哪几种方法？5)蛋白质一级结构N末端，C末端，氨基酸残基(共价主链)，侧链。蛋白质一级结构概念

蛋白质是由不同种类，数量和排列顺序的氨基酸，通过肽键相连而构成的高分子有机含氮化合物。蛋白质的一级结构是其作用的特异性，空间结构的差异性和生物学功能多样性的基础。（二）、蛋白质一级结构测定

研究蛋白质的一级结构从确定组成蛋白质的单元结构—氨基酸算起，已有150年的悠久历史，直到1953年，Sanger首次阐明胰岛素的氨基酸排列顺序，为研究蛋白质的一级结构开辟了道路。这在分子生物学的发展进程中是一个重要突破。目前关于核酸的一级结构研究，由于Sanger等发明了加减法，得到了突飞猛进的发展。

为什么要进行蛋白质一级结构的测定（或者说确定组成蛋白质的氨基酸种类，数量，排列顺序）？有以下原因：蛋白质一级结构的确定有助于阐明蛋白质一级结构与空间结构的关系。蛋白质一级结构的确定有助于认识蛋白质一级结构与生物学功能的关系。蛋白质一级结构的确定有助于揭示蛋白质一级结构的变化与疾病的关系。蛋白质一级结构的确定有助于了解生物进化中蛋白质的作用。蛋白质一级结构测定内容蛋白质分子中氨基酸组成分析(aminoacidcompositionanalysis)

蛋白质分子中氨基酸排列顺序分析蛋白质一级结构测定步骤(基本了解）蛋白质样品的纯化蛋白质分子中多肽链数目的测定氨基酸组成的分析大分子多肽氨基酸顺序的确定

蛋白质样品的纯化

蛋白质样品的纯化方法将于本章第六节中具体阐述，但用于测序的蛋白质样品必需纯（纯度>97%）。蛋白质分子中多肽链数目的测定

根据末端分析测定蛋白质末端氨基酸残基(N末端或C末端)数和蛋白质的分子量可以确定蛋白质分子中多肽链的数目。因为一个蛋白质多肽链只有一个C末端和一个N末端，所以多个末端就意味着有多条多肽链，也就是一个蛋白质分子由多条多肽链组成。那该怎么办？-------使用物理的或化学的方法将其拆成单亚基，如使用SDS

反之，已知蛋白质分子量和N末端数目(或C末端数目)即可求出该蛋白质分子是由几条多肽链组成的。末端分析方法(P70)

由于方法较多，我们只介绍较常用的几种。

N末端氨基酸分析

二硝基氟苯法丹磺酰氯法（二甲氨基萘磺酰氯法）苯异硫氰酸酯法（Edman顺序降解法）氨肽酶法

C末端氨基酸分析肼解法羧肽酶法①N-末端测定A.二硝基氟苯（DNFB）法：

1945年Sanger提出此方法，是他的重要贡献之一。蛋白质或多肽的N末端氨基与DNFB反应，生成DNP-多肽衍生物。由于DNP基团与氨基酸新形成的键对酸的稳定性远较肽键高，不易被酸水解，可用有机溶剂将DNP-氨基酸提取而与其它氨基酸分开，分离出的DNP-氨基酸可用纸层析，TLC和HPLC进行定性和定量分析。

Sanger用此方法测定了胰岛素的N-末端分别为甘氨酸及苯丙氨酸。 除N端氨基酸之外，侧链NH2也可有此反应，但反应较慢，且生成的DNP-AA不溶于乙酸乙酯，而保留在水相中。B.二甲基氨基萘磺酰氯法(DNS法) 1956年Hartley等报告了一种测定N-末端的灵敏方法，采用1-二甲基氨基萘-5-磺酰氯，简称丹磺酰氯。丹磺酰氯与游离氨基末端作用，方法类似于Sanger的DNFB法，产物是磺酰胺衍生物DNS-氨基酸。

DNS-氨基酸具有强烈的黄色荧光。此法优点为灵敏性较高(比FDNB法提高100倍)及丹磺酰氨基酸稳定性较高(对酸水解稳定性较DNP-氨基酸高)，可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析鉴定。

C.苯异硫氰酸酯(PITC)法又称Edman顺序降解法。苯异硫氰酸酯与肽的N末端氨基反应生成苯氨基硫甲酰基衍生物(PTC-肽)。在酸性中，PTC-肽经裂解环化生成苯乙内酰硫脲氨基酸(PTH-氨基酸)和剩余多肽(N-末端少一个氨基酸的多肽)。PTH-氨基酸可用醋酸乙酯抽提后进行鉴定。蛋白质氨基酸顺序分析仪就是依据Edman顺序降解法的原理设计而成的。

D.氨肽酶(aminopeptidases)法

氨肽酶是一类肽链外切酶(exopeptidases)或叫外肽酶。 它们能从多肽链的N端开始逐个切掉氨基酸。根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量做动力学曲线，就能知道该蛋白质的N端残基顺序。实际上此法用于测定N端氨基酸有许多困难，因为酶对各种肽键敏感性不一样，常常难以判断哪个残基在前，哪个残基在后。②C-末端分析

A.肼解法(hydrazinolysis)：

这是测定C-末端最常用的方法。将多肽溶于无水肼中，100℃下反应5~10小时，结果羧基末端氨基酸以游离氨基酸释放，而其余肽链部分与肼生成氨基酸酰肼化合物。

反应中生成的氨基酸酰肼化合物可与苯甲醛作用变为水不溶性的二苯基衍生物而沉淀。 上清液中游离的羧基末端氨基酸可借助于DNFB法或DNS法以及层析技术进行鉴定。 如果羧基末端氨基酸侧链是带有酰胺如天冬酰胺和谷氨酰胺，或者是半胱氨酸，则肼解时被破坏不能产生游离的羧基末端氨基酸。 精氨酸会转变成鸟氨酸。 此外肼解时注意避免任何少量的水解，以免释出的氨基酸混淆末端分析。

B.羧肽酶法： 羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶A、B和C。应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学实验，以便选择合适的酶浓度及反应时间，使释放出的氨基酸主要是C末端氨基酸。

目前最常用有羧肽酶A和B。

羧肽酶A：当C端为Lys、Arg和Pro时，或倒数第二个氨基酸为Pro时，该酶均不能作用。 羧肽酶B：只能水解以碱性氨基酸Lys、Arg为C端残基的肽键，且倒数第二个氨基酸为Pro时，该酶不能作用。氨基酸组成的分析

在进一步分析多肽链的氨基酸顺序之前，首先应了解它是由那几种氨基酸组成的，每种氨基酸有多少。可以使用氨基酸自动分析仪。大分子多肽氨基酸顺序的确定酶解法和化学裂解法气-质谱连用法(GC-MS)核酸推导法P72A.酶解法和化学裂解法适用于无二硫键的一条多肽链组成的蛋白质。

B.气-质谱连用法(GC-MS)

是一种不同于Edman降解和酶解的物理化学方法，具有样品用量少，分析速度快的优点，但是设备昂贵。由于课时限制，方法的原理此处不作介绍。C.核酸推导法

目前由于DNA测序技术相当成熟，所以核酸推导法是确定蛋白质一级结构最有效的方法。其原理是蛋白质的氨基酸顺序由核酸的核苷酸顺序决定，只要测出核苷酸顺序即可根据密码子推导出氨基酸顺序。(详见核酸与蛋白质生物合成部分)。二.蛋白质的构象(conformation)

蛋白质的分子构象又称空间结构、立体结构、高级结构或三维构象等。它包括二级结构，三级结构和四级结构。蛋白质分子构象是指蛋白质分子中原子和基团在三维空间上的排列分布及肽键的走向。X-射线衍射结构分析法

通过单色的X射线，穿过蛋白质晶体，产生的衍射图，对衍射图中斑点的位置与强度进行测定和计算，可确定晶体的结构，但并非所有的蛋白质都能得到好的晶体。氨基酸顺序检测表明：每一种蛋白质都具有其特异而严格的氨基酸种类、数量和排列顺序。（一）、维持蛋白质构象的化学键

蛋白质一级结构的主要化学键是肽键也有少量二硫键。而维持蛋白质空间结构的化学键主要是一些次极键。次极键虽然键能小，稳定性差，但由于数目众多，因此在维持蛋白质分子的空间构象中起极为重要的作用。主要的次极键有：氢键，疏水键，盐键，配位键，二硫键。1、氢键由连接在一个电负性大的原子上的H与另一个电负性大的原子相互作用而成，氢键是次极键中键能做弱的，但数目最多，所以是最重要的次极键，也是维持蛋白质二级结构的主要次极键。2、疏水键由两个非极性基团，因避开水相而群集在一起的作用力，是维持蛋白质三级，四级结构的主要次极键。

3、盐键(又叫离子键)

它是蛋白质分子中带正电荷基团和负电荷基团之间的静电吸引所形成的化学键。4、配位键蛋白质与金属离子结合中，常含有配位键，如细胞色素，血红蛋白等均含有铁与蛋白质形成的配位键。5、二硫键是由两个硫原子间所形成的化学键(较强的化学键)。6、范德华(引)力

是原子、基团或分子间的一种弱的相互作用力.(二)、蛋白质的二级结构

secondarystructureofprotein

蛋白质二级结构是指多肽链的主链骨架中若干肽单位，各自沿一定的轴盘旋或折叠，并以氢键为主要次级键而形成的有规则的构象，如α-螺旋（α-helixstructure）、β-折叠（β-pleatedsheet）、β-转角（β-bend）和无规则卷曲（randomcoil）等。蛋白质二级结构一般不涉及氨基酸残基侧链的构象。

所以二级结构概念的要点：1）肽单位2）氢键为主要次级键（氢键是稳定二级结构的主要键）3）二级结构种类（α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲）4）不涉及氨基酸残基侧链肽单位（peptideunit）

肽键与相邻的两个α-C原子所组成的残基，称为肽单位、肽平面或酰胺平面(amideplane)。

肽单位有这样一些特性：

(1)早在1925年，Pauling等人就发现，肽键中的C-N键长0.132nm，比相邻的C-N单键(0.147nm)短，而较一般C=N双键(0.128nm)长。可见，肽键中-C-N-键的性质介于单、双键之间，具有部分双键的性质，因而不能旋转，这就将其固定在一个平面之内。

(2)肽键的C及N周围三个键角之和均为360°，说明都处于一个平面上，也就是说肽单位的六个原子基本上同处于一个平面，是一个刚性平面，这就是肽键平面。

肽链中能够旋转的只有α-碳原子所形成的单键，此单键的旋转决定两个肽键平面的位置关系，于是肽平面成为肽链盘曲折叠的基本单位。

(3)肽键中的C-N既然具有双键性质，就会有顺反不同的立体异构，已证实肽单位中亚氨基的氢原子和羰基中的氧原子与两个α-碳原子呈反向分布。

-螺旋（

-helix）

Pauling等人对α-角蛋白(α-keratin)进行了X射线衍射分析，从衍射图中看到有0.5～0.55nm的重复单位，故推测蛋白质分子中有重复性结构，并认为这种重复性结构为α-螺旋。概念：指蛋白质分子中多个肽键平面通过氨基酸α-C原子的旋转使多肽链的主骨架沿中心轴盘曲形成的稳定的构象。

α-螺旋的结构特点如下：

①多个肽平面通过α-碳原子旋转，相互之间紧密盘曲成稳固的右手螺旋。

② 主链呈螺旋上升，每3.6个氨基酸残基上升一圈，相当于0.54nm。肽平面和螺旋长轴平行。

③相邻两圈螺旋之间借肽键中C＝O和H形成许多链内氢键，即每一个氨基酸残基中的NH和前面相隔三个残基的C＝O之间形成氢键，这是稳定α-螺旋的主要键。

④肽链中氨基酸侧链R，分布在螺旋外侧，其形状、大小及电荷影响α－螺旋的形成。

酸性或碱性氨基酸集中的区域，由于同电荷相斥，不利于α－螺旋形成；较大的R(如苯丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸)集中的区域，也妨碍α-螺旋形成；脯氨酸因其α-碳原子位于五元环上，不易扭转，加之它是亚氨基酸，不易形成氢键，故极难形成上述α-螺旋；甘氨酸的R基为H，空间占位很小，也会影响该处螺旋的稳定。

-折叠(-pleatedsheet)

Astbury等人曾对β-角蛋白进行X-射线衍射分析，发现具有0.7nm的重复单位。如将毛发α-角蛋白在湿热条件下拉伸，可拉长到原长二倍，这种α-螺旋的X线衍射图可改变为与β-角蛋白类似的衍射图。说明β-角蛋白中的结构和α-螺旋拉长伸展后结构相同。卷发(烫发)的生物化学基础永久性卷发(烫发)是一项生物化学工程(biochemicalengineering),

-角蛋白在湿热条件下可以伸展转变为

-构象，但在冷却干燥时又可自发地恢复原状。这是因为

-角蛋白的侧链R基一般都比较大，不适于处在

-构象状态，此外

-角蛋白中的螺旋多肽链间有着很多的二硫键交联，这些交联键也是当外力解除后使肽链恢复原状(

-螺旋构象)的重要力量。这就是卷发行业的生化基础。

两段以上的这种折叠成锯齿状的肽链，通过氢键相连而平行成片层状的结构称为β-折叠或称β-片层结构。

β-折叠结构特点是：

①是肽链相当伸展的结构，肽平面之间折叠成锯齿状，相邻肽平面间呈110°角。

②依靠两条肽链或一条肽链内的两段肽链间的C＝O与H形成氢键，使构象稳定。

③两段肽链可以是平行的，也可以是反平行的。即前者两条链从“N端”到“C端”是同方向的，后者是反方向的。

β-折叠结构的形式十分多样，正、反平行能相互交替。平行的β-折叠结构中，两个残基的间距为0.65nm；反平行的β-折叠结构，则间距为0.7nm。

④氨基酸残基的R侧链分布在片层的上方或下方。

-转角

(β－turn)

蛋白质分子中，肽链经常会出现180°的回折，在这种回折角处的构象就是β-转角或称β-折角(β-blend)。β-转角中，第一个氨基酸残基的C＝O与第四个残基的N-H形成氢键，从而使结构稳定。

无规线团(randomcoil)

又称无规卷曲或卷曲，它泛指那些不能被归入明确的二级结构如折叠或螺旋的多肽区段。必须指出卷曲这个术语容易引起误解。实际上这些区段大多数既不是卷曲，也不是完全无规的。这些“无规线团”也像其它二级结构那样是明确而稳定的结构，否则蛋白质就不可能形成三维空间上的每维都具周期性结构的晶体。但是它们受侧链相互作用的影响很大。这类有序的非重复性结构经常构成酶活性部位和其它蛋白质特异的功能部位。

事实上，许多蛋白质的二级结构并非单纯的α-螺旋、β-折叠、β-转角结构，而是这些不同类型构象的组合，只是不同的蛋白质所含多少不同而已。见P77,表4-5超二级结构(super-secondarystructure)

超二级结构是指在多肽链内顺序上相互邻近的二级结构常常在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成规则的，在空间上能辨认的二级结构聚集体。它们可直接作为三级结构的“建筑块”或结构域的组成单位，是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的一个层次，故称超二级结构。目前发现的超二级结构有三种基本形式：α螺旋组合(αα)；β折叠组合(βββ)和α螺旋β折叠组合(βαβ)，其中以βαβ组合最为常见。αα：由两股或三股右手α螺旋彼此缠绕而成，立足α角蛋白，肌球蛋白，纤维蛋白原中的一种超二级结构。βββ：由β折角和回形拓扑结构形成的超二级结构。βαβ：最常见的βαβ组合是由三段平行式的β链和二段α螺旋链构成。a.αα组合b.βββ组合c.βαβ组合(三)蛋白质的三级结构

1.概念

蛋白质的三级结构(tertiarystructure)是指多肽链中所有原子或基团的空间排列，也就是多肽链在二级结构的基础上，由氨基酸残基侧链基团的相互作用使多肽链进一步盘旋或折叠，导致整个分子形成不规则的特定构象。2.结合力

蛋白质三级结构的稳定主要靠次级键，包括氢键、疏水键、盐键以及范德华力等。

这些次级键可存在于一级结构序号相隔很远的氨基酸残基的R基团之间，因此蛋白质的三级结构主要指氨基酸残基的侧链间的结合。次级键都是非共价键，易受环境中pH、温度、离子强度等的影响，有变动的可能性。二硫键属于共价键，但在某些肽链中能使远隔的二个肽段联系在一起，这对于蛋白质三级结构的稳定上起着重要作用。

结构域(domain)

在学习三级结构的同时，我们还必须掌握一个重要的概念----结构域（structuraldomain）

结构域是蛋白质三维折叠中的一个层次，主要是相邻的二级结构片段集装在一起形成超二级结构，在此基础上，进一步折叠成近乎球状，相对独立的三维实体，这个区域称为结构域。由此可见：结构域：1）构成基础是超二级结构，2）相当独立区域，3）属于三级结构。而超二级结构概念：蛋白质分子中α-螺旋，β-折叠，β-转角等集合在一起，彼此相互作用，形成有规则的在空间上能辨认的二级结构组合体，称超二级结构，有三种类型。

一般每个结构域约由100-200个氨基酸残基组成，各有独特的空间构象，并承担不同的生物学功能。如免疫球蛋白(IgG)由12个结构域组成，其中两个轻链上各有2个，两个重链上各有4个；补体结合部位与抗原结合部位处于不同的结构域。一个蛋白质分子中的几个结构域有的相同，有的不同；而不同蛋白质分子之间肽链中的各结构域也可以相同。如乳酸脱氢酶、3－磷酸甘油醛脱氢酶、苹果酸脱氢酶等均属以NAD+为辅酶的脱氢酶类，它们各自由2个不同的结构域组成，但它们与NAD+结合的结构域构象则基本相同。肌红蛋白的三级结构和丙糖磷酸异构酶的三级结构图(四)蛋白质的四级结构

概念

(1)亚基

(subunit)

亚基也叫做亚单位，也有人称之为原聚体或单体。由一条多肽链折叠而成，具有一二三级结构。 一般亚基没