THXCY 99-2024 紫花苜蓿高通量基因型鉴定分析技术规程

ICS65.020.01B20团体 标准T/HXCY99-2024紫花苜蓿高通量基因型鉴定分析技术规程TechnicalRegulationsforHighThroughputGenotypeIdentificationandAnalysisofAlfalfa2024-12-21布 2024-12-24北京华夏草业产业技术创新战略联盟发布1IIT/HXCY99—2024目 次前 言 II范围 1规性用件 1术和义 1技原理 1仪设备 2测方法 3生信分析 4测报告 5IIIIT/HXCY99—2024前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本标准由北京华夏草业产业技术创新战略联盟提出并归口。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。T/HXCY99—2024T/HXCY99—2024PAGEPAGE1紫花苜蓿高通量基因型鉴定分析技术规程范围本文件规定了紫花苜蓿（MedicagosativaL.）高通量基因型鉴定分析的技术原理、仪器设备、测试方法、生物信息分析和测试报告。本文件适用于紫花苜蓿高通量基因型鉴定分析。规范性引用文件包括GB/T30989GB/T40171DNAT/JSFT/JSF001美洲黑杨性别苗期鉴定技术规程——SSR分子标记法术语和定义下列术语和定义适用于本文件。DNAlibrary将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆，这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库。探针probe识别特定碱基序列，经人工标记的小段单链核酸分子。high-throughputsequencing100Mb引物primerDNADNApolymerase它是以亲代DNA为模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一类酶。DNADNAligase在DNA复制、修复和重组过程中，能够催化DNA链之间的磷酸二酯键形成的酶。SNPSNPmarker在基因组上由单个核苷酸变异形成的遗传标记。liquid-phasegenechip靶向测序分型技术GenotypingbyPinpointSequencingofliquidcapturedtargets（cGPS）SNP/InDel技术原理SNP/InDel仪器设备PCR仪PCR仪ArraySNPline测试方法DNA提取与质控NBT3089执行；使用QubitDNA1%DNA5010ng/µL；6.1.4OD260/280应为1.8~2.0，OD260/230不小于1.8的样品宜用于文库制备。cGPS文库构建与质控利用酶切试剂将DNA样品酶切成100~500bpTaq3’A使用T4DNA后的产物使用Qubit连接产物进行PCRQubit荧光定量仪检测浓度，使用琼脂糖凝胶电泳检测片段；200ng质检合格的PCRRNA（RnaseBlock）5016~24h完成30~60minPCRcGPS上机测序文库构建完成后，应利用Qubit荧光定量仪对文库浓度测定，采用Agilent2100/2200Bioanalyzer检测文库质量，文库片段宜250~500bp。文库质检合格后，按测序平台标准进行上样及测序。生物信息分析测序数据质控测序数据质控测序数据格式测序得到的原始图像数据文件应通过碱基识别（BaseCalling）分析转化为测序序列原始数据过滤（Rawfastp低质量的Reads，得到高质量的CleanReads测序数据质量评估Phred（Phredscore，Qphred）碱基分布检查应用于检测AT、GC分离现象。G和C碱基及A和T碱基含量在每个测序循环上应分别对等，且测序过程应稳定不变，呈水平线。7.1.57.1.5测序数据污染检测每个样品的fastq文件中随机选择1万条序列，利用Blastn将序列比对到NCBInr/nt数据库对污染评估。参考基因组比对BWACleanReads4号”等紫花苜蓿参考基因组比对，定位CleanReads60K目标位点变异分析DNASNP、InDelCleanReads工具HaplotypeCaller对靶向位点基因型检测；利用组中发生的区域，包括内含子区、基因间区、编码区、5’端UTR区、3’端UTR区等，以及变异产生的同义、非同义突变等影响。测试报告测试报告应包括下列内容：—样本信息；—靶向测序基因型分型技术；