HSP70在香烟诱导气道粘液高分泌机制

HSP70在香烟诱导气道MUC5AC表达的作用

及其机制研究

研究生：张明周

指导教师：冯玉麟教授文富强教授内容

前言1材料与方法2

结果3

讨论4CompanyLogo前言CompanyLogo研究背景我国烟草产量相当于世界第2大香烟生产国美国的4倍，有烟民3.2亿，是世界吸烟总人数的1/4。吸烟是诱发和加重多种呼吸系统疾病的重要原因之一。吸烟所致的气道粘液高分泌可以加速患者肺功能的进一步下降，使患者病情恶化频率及死亡的危险性增高。CompanyLogo研究背景据中国疾病监测系统的报告：每年吸烟引起相关疾病在我国造成60万人死亡；以目前的吸烟的严峻形势预测，现在29岁以下的3亿男性中，有1亿人将因吸烟而过早死亡，其中半数死于中年。吸烟相关呼吸系统疾病的致残率之高也相当惊人。CompanyLogo研究背景气道黏液高分泌是多种呼吸道慢性炎症疾病如慢性支气管炎、支气管哮喘、支气管扩张和肺囊性纤维化等的重要特征。在慢性炎症状态下，黏蛋白分泌异常、呼吸道腔内黏液纤毛清除功能障碍，导致呼吸道细菌定植、黏液栓形成、气体交换障碍等。CompanyLogo研究背景热休克蛋白(heatshockproteins，HSPs)是一组由生物细胞(包括原核细胞及真核细胞)在应激原刺激后，发生热休克反应时所产生的一类细胞蛋白。HSP70是其中重要的一种。HSP70有多种生物活性作用，例如分子伴侣作用、抗凋亡、抗氧化等作用。CompanyLogo研究背景目前有关HSP70与粘液高分泌的作用研究集中在与富含丙氨酸的豆蔻酰化的激酶C底物（MARCKS）参与粘蛋白分泌过程。根据上述研究结果我们假设HSP70可能通过某些其他途径不仅参与了粘蛋白的分泌，而且合成的过程。H.R.Wong，AmJPhysiolLungCellMolPhysiol.1997;273:L1-L9.CompanyLogo研究背景实验原理（一）

HSP70蛋白氨基端具有弱的ATPase活性，在给予相应的单抗抑制其N端ATP酶的功能后，HSP70的生物学活性丧失。实验拟通过HSP70单抗阻断HSP70生物活性，探讨HSP70在粘液高分泌中的作用及其机制。CompanyLogo研究背景实验原理（二）香烟提取物（cigarettesmokingextractionCSE）是香烟烟雾的溶解液，含有香烟烟雾的主要成分，可作为香烟替代物用于细胞烟熏刺激的研究。Chao-JunLi,AmJPhysiolLungCellMolPhysiol,2007;292:L1297-L1303.Vayssier-TaussatM,AmJPhysiolHeartCircPhysiol280:H1293–H1300,2001.CompanyLogo研究背景利用CSE的上述特性，实验通过CSE干预气道上皮细胞，作为粘液高分泌模型的干预刺激因素。CompanyLogo材料与方法CompanyLogo材料与方法1耗材试剂2主要仪器3试验方法CompanyLogo材料与方法鼠抗人HSP70抗体引物探针（HSP70、β-actin）引物探针（MUC5AC、TNF-α）五牛牌香烟（焦油含量：16mg，烟气烟碱量：1.2mg）鼠二抗β-actin抗体蛋白质分子量makerPVDF膜X光片Phospho-EGFR鼠抗人抗体HSP70兔抗人单抗RT-PCR试剂盒westernblot检测试剂盒DMEM培养基细胞培养瓶1.耗材试剂CompanyLogo材料与方法100%CSE母液DMEM培养基PBSwesternboltrunningbuffer4×stackingbuffer4×seperatingbuffer10%SDS-聚丙烯酰胺分离胶15%SDS-聚丙烯酰胺基层胶cathodebufferAnodebuffer10×TBSTBST50×TAE试剂名称剂量DMEM培养基20ml香烟4支燃烧后烟雾溶解至培养基中调PH值至7.0过滤除菌，4℃储藏CompanyLogo材料与方法2.主要仪器生物安全柜PTC-200DNAENGinePCR扩增仪EppendorfCentrifuge5415D制胶器及垂直平板电泳仪电转仪核酸蛋白定量仪水平电泳仪JD200-3型光学显微镜QuantityOne图像分析软件SK-1快速匀浆仪HB2460超净工作台GelDoc1000凝胶成像系统温控高速离心机Bio-RAD680蛋白定量仪KA-1000型台式低速离心机二氧化碳培养箱MCO-175AICompanyLogo实验方法实验步骤：CSE干预HBE细胞黏液高分泌模型制作实验结果的统计分析和判断检测各项指标阻断黏液高分泌模型HSP70生物活性CompanyLogo实验方法1.CSE干预下HBE细胞模型制作1.1细胞复苏和培养

放入37℃，5%CO2孵箱培养，培养24h后镜下观察细胞解冻

细胞离心

接种冻存细胞株（16-HBE）在37℃左右迅速解冻转入离心管内离心（转速800转/min）用含10%小牛血清的DMEM培养基吹打细胞，最后接种于25ML培养瓶以及培养皿中CompanyLogo实验方法1.2细胞传代培养

HBE细胞加入胰酶消化镜下观察，适度消化后，吹打细胞，细胞计数平均分配接种于新培养皿中，孵箱培养CompanyLogo实验方法1.3细胞CSE干预取对数生长期的HBE细胞，采用上述传代方法接种于培养皿中，37℃、5％CO2，孵箱中培养，待细胞生长单层融合后，予以无血清培养基饥饿使细胞同步化后采取下述方法干预：CompanyLogo实验方法1.3.1药物干预浓度梯度：以前述方法配制的CSE作为100%母液预先用DMEM稀释至设置浓度后加入下列各组细胞。在孵箱中培养24h后观察、检测。分组CSE浓度CTL0CSE1%组1%CSE2%组2%CSE4%组4%CSE8%组8%CSE15%组15%CSE20%组20%CSE30%组30%CompanyLogo实验方法1.3.2药物干预时间梯度：设置各时间组，以CSE8%作为干预浓度，同上述方法干预，分别于相应时间收集标本观察、检测。处理12h收集空白组干预组空白组干预组

空白组干预组48h收集24h收集CompanyLogo实验方法MTT实验收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔孵育至细胞单层铺满孔底,加入浓度梯度的药物,方法同上孵育16-48小时，镜下观察。每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。设置调零孔,酶联免疫测定仪测定波长490nm处的吸光度。取5孔吸光度的均值绘图。CompanyLogo实验方法2.对细胞模型的HSP70生物活性干预2.1细胞复苏和培养同前（略）2.2细胞传代培养同前（略）2.3细胞CSE和HSP70单抗浓度梯度干预培养传代方法同前，饥饿同步化后予以下述方法分组并给与试剂，培养24h后收集标本。CompanyLogo实验方法0.1mg/ml8%CSE8%组+HSP70单抗(0.1mg/ml)1.0mg/ml8%CSE8%组+HSP70单抗(1.0mg/ml)2.0mg/ml8%CSE8%组+HSP70单抗(2.0mg/ml)0.5mg/ml8%CSE8%组+HSP70单抗(0.5mg/ml)08%CSE8%组00CTLHSP70单抗CSE分组CompanyLogo实验方法2.4细胞CSE和HSP70单抗干预

培养方法同上，待细胞生长单层融合后，予以无血清培养基饥饿使细胞同步化后予以下述方法分组并给与试剂，37℃、5％CO2，孵箱中继续培养24h后收集标本。2mg/ml00HSP70antibody8%8%0CSECSE8%组+HSP70单抗CSE8%组CTLCompanyLogo实验方法3.检测各项指标3.1RT-PCR3.1.1细胞总RNA提取和浓度测定细胞裂解RNA溶解离心移出

沉淀RNA离心洗涤震荡干燥RNA样品定量和纯度分析CompanyLogo实验方法3.1.2逆转录合成cDNA采用RevertAidTMFirststrandCdnaSynthesisKit﹟K1622，在PCR仪上进行扩增，步骤如下：(1)在冰上混匀下述溶液试剂名称

剂量totalRNA5ugrandomprimer1ul加DEPC水至12ul(2)瞬时离心，65℃孵育5min，冰上冷却；CompanyLogo实验方法(3)冰上加入下列试剂

混匀瞬时离心，37℃孵育5min；(4)在冰上加入ReverAidTmM-MuLVreverseTranscr-iptase(200u/ul)1ul,25℃孵育5min，再42℃孵育60min，加热至70℃下5min终止反应。试剂名称

剂量totalRNA5ugrandomprimer1ul加DEPC水至12ulCompanyLogo实验方法

3.1.3引物设计与合成所用引物序列primerprimer5.0自行设计，由上海英骏生物技术公司合成。引物序列及扩增片段大小如下：基因引物片段扩增片段大小IL-8上游(5’-AATGGGTTTGCTAGAATGTG-3’)下游(5’-CTGTGAGGTAAGATGGTGGC-3’)227bpMUC5AC上游(5’-TGATCATCCAGCAGCAGGGCT-3’)下游(5’-CCGAGCTCAGAGGACATATGGG-3’)408bpβ-actin上游(5’-TGGAGAAAATCTGGCACCAC-3’)下游（5’-GAGGCGTACAGGGATAGCAC-3’）200bpHSP70上游(5’-GGAGACAGCCGAAAGTGTTC-3’)下游（5’-TTTCTACCTCCCAATGTCGTG-3’）327bpTNF-α上游(5’-CAGAGGGAAGAGTTCCCCAG-3’）下游(5’-CCTTGGTCTGGTAGGAGACG－3’)201bpCompanyLogo实验方法3.1.4PCR反应体系如下

试剂名称剂量cDNA2.5ulddH2O9ulprimerF(25pmmol)0.5ulprimerR(25pmmol)0.5ulTaqmix12.5ul总体积为25ulCompanyLogo实验方法3.1.5PCR反应循环温度如下95℃，4min95℃，30sec58-62℃,30sec72℃，45sec72℃，5min×28-35cyclesCompanyLogo实验方法3.1.6琼脂糖电泳

(1)制胶

(2)加样，电泳

(3)扫描成像，摄影。3.1.7图像分析

电泳图利用QuantityOne软件进行分析，分别计算和比较目的条带、内参β-actin的灰度值，评估目的基因表达量，比值大说明目的基因表达量多。CompanyLogo实验方法3.2westernblot3.2.1蛋白质提取标本用预热的PBS液（37℃）冲洗干净培养基，加入预先冰冻的裂解液50ul和蛋白酶抑制剂1ul，充分混匀裂解用细胞板刮下裂解细胞，转入1ml离心管中，超声打碎使细胞完全裂解后静置15min4℃离心15min（14000转/min)后收集上清液-70℃保存CompanyLogo实验方法3.2.2蛋白浓度测定配制蛋白标准溶液配制工作液设置标准品孔加样孵育测定和计算样品的蛋白浓度。CompanyLogo实验方法凝胶板制备加样电泳蛋白质从SDS凝胶转移至固相支持体ECL显色对固定于PVDF膜上的蛋白质进行染色抗体检测蛋白表达3.2.3SDS凝胶电泳CompanyLogo实验方法3.2.4结果分析和判断

将所得图形扫描，利用图象分析软件测定目的条带和内参对照的光密度值，以两者比值表示目的蛋白的相对含量，进行统计分析。CompanyLogo实验方法4.统计分析数据均以(±s）表示，应用SPSS11.0软件进行统计学处理。组间差别采用方差分析，相关性采用Bivariate二元变量的相关分析。P<0.05表示差异有统计学意义。CompanyLogo结果CompanyLogo结果1.MTT实验结果分析实验中吸光度值在CSE1～30%浓度区域刺激24小时HBE细胞中呈浓度依赖性降低，以空白组为参照比值如下图，提示CSE对HBE细胞有细胞毒性损伤作用，能够引起HBE细胞活力下降，降低细胞存活率。

*与空白组吸光度比值比较1%2%CTL4%8%15%20%30%*******

CSE干预下HBE细胞MTT实验结果CompanyLogo结果各组细胞均有一定程度IL-8mRNA的表达，与空白组电泳灰度值比较结果提示：在CSE1～8%区域内，IL-8mRNA表达随着CSE刺激浓度增加而增高，呈浓度依赖关系(p<0.01)。

2.CSE诱导IL-8mRNA的表达

浓度梯度CSE诱导IL-8mRNA的表达*p<0.01vs.CTL组1%2%4%8%15%00.20.40.60.81CTL*****CompanyLogo结果IL-8CSE浓度β-actin

CSE浓度梯度下IL-8RT-PCR电泳图CompanyLogo结果各组细胞均有一定程度MUC5ACmRNA的表达与空白组电泳灰度值比较结果提示：在CSE2～8%区域内，MUC5ACmRNA表达随着CSE刺激浓度增加而增高，呈浓度依赖关系（p<0.01）。

3.CSE诱导MUC5ACmRNA的表达浓度梯度CSE诱导MUC5ACmRNA的表达*p<0.01vs.CTL组2%4%8%15%CTL****CompanyLogo结果CSE浓度CSE浓度梯度下MUC5ACRT-PCR电泳图CompanyLogo结果4.1CSE诱导HSP70mRNA的表达RT-PCR与空白组电泳灰度值比较结果提示：在CSE1～8%区域内，HSP70mRNA表达随着CSE刺激浓度增加而增高，呈浓度依赖关系（p<0.05）。4.CSE诱导HSP70蛋白和基因的表达

浓度梯度CSE诱导HSP70mRNA的表达RT-PCR*p<0.05vs.CTL组2%4%8%15%CTL****1%*CompanyLogo结果CSE浓度β-actinHSP70CSE浓度梯度下HSP70RT-PCR电泳图CompanyLogo结果4.2CSE诱导HSP70蛋白westernblot结果在8%CSE刺激后12～48h过程中，HSP70蛋白的表达较对照组明显增加；随着刺激时间的延长，HSP70蛋白表达增高呈时间依赖关系(p<0.05)。*p<0.05vs.CTL组48h12h***24h

时间梯度CSE诱导HSP70蛋白westernblot结果CompanyLogo结果CSE浓度和时间β-actinHSP70CSE时间梯度下HSP70westernblot图CompanyLogo结果与空白组电泳灰度值比较结果提示：CSE干预组TNF-αmRNA的表达显著增高，CSE+HSP70抗体组较CSE干预组TNF-αmRNA的表达降低（p<0.05）。5.CSE及HSP70抗体干预后TNF-αmRNA的表达*p<0.05vs.CTL组、**p<0.05vs.8%CSE组CSE8%+AbCTL***CSE8%CSE及HSP70抗体干预后TNF-αmRNA的表达CompanyLogo结果TNF-αβ-actinCSE及HSP70干预下TNF-αRT-PCR电泳图CompanyLogo结果6.CSE及HSP70抗体干预后MUC5ACmRNA的表达与空白组电泳灰度值比较结果提示：CSE干预组MUC5ACmRNA的表达显著增高，CSE+HSP70抗体组较CSE干预组MUC5ACmRNA的表达降低（p<0.05）。*p<0.05vs.CTL组、**p<0.05vs.8%CSE组CSE8%+AbCTL***CSE8%CSE及HSP70抗体干预下HBE细胞MUC5ACmRNA的表达CompanyLogo结果CSE及HSP70干预下MUC5ACRT-PCR电泳图β-actinMUC5ACCompanyLogo结果7.CSE、HSP70单抗浓度梯度干预后p-EGFR表达水平CSE刺激后EGFR磷酸化水平较对照显著增高(p<0.05)，HSP抗体干预组EGFR磷酸化水平较CSE刺激组降低，并与培养基中HSP抗体浓度梯度相关*****CTLABCDE**p<0.05vs.**,**p<0.01vsCTL.A:CSE8%组B:CSE8%组+HSP70单抗(0.1mg/ml)C:CSE8%组+HSP70单抗(0.5mg/ml)D:CSE8%组+HSP70单抗(1.0mg/ml)E:CSE8%组+HSP70单抗(2.0mg/ml)CSE、HSP70单抗浓度梯度干预后p-EGFR表达水平CompanyLogo结果β-actinp-EGFRCSE、HSP70单抗浓度梯度干预后p-EGFR表达水平CompanyLogo讨论CompanyLogo讨论MTT实验中，吸光度值在CSE1～30%浓度区域刺激24小时HBE细胞中呈浓度依赖性降低，表明CSE对HBE细胞有细胞毒性损伤作用存活率下降。CSE浓度大于15%时，吸光度值明显下降，在后来的实验中设置干预浓度梯度时,选择干预浓度浓度低于15%。30%1%2%CTL4%8%15%20%CSE干预下HBE细胞存活率变化曲线CompanyLogo讨论IL-8是一种多细胞炎性介质，多种细胞均可在各自适宜的条件刺激下合成。能在炎症中发挥持续效应，放大炎症反应。基于上述IL-8的特性，我们以其在HBE细胞表达作为干预模型制作成功的指标。实验结果如前所述，表明CSE能够对HBE细胞进行有效的干预。CompanyLogo讨论人粘蛋白基因在气道杯状细胞主要表达MUC5AC。因此试验中选择MUC5AC作为粘液高分泌的指标。MUC5ACmRNA表达随着CSE刺激浓度增加而增高，呈浓度依赖关系。CSE干预HBE可以作为粘液高分泌模型。CompanyLogo讨论实验也证实HBE细胞HSP70mRNA表达也呈现CSE刺激浓度依赖关系。提示热休克蛋白70也参与了CSE对人类支气管上皮细胞的刺激作用过程。同时模型中MUC5AC和HSP70mRNA表达同步增高，提示HSP70可能参与了MUC5AC高表达。CompanyLogo讨论表皮生长因子受体(EGFR)是存在于细胞表面的重要细胞因子受体，参与多种生物学过程；EGFR在吸烟所致气道粘液分泌中有重要作用，其机制是通过与配体结合后胞内的氨基酸残端磷酸化，激活核内的mucin基因的表达诱导粘蛋白的生成。磷酸化EGFR量的增加提示EGFR-MUC5AC通路的激活。

CompanyLogo讨论肿瘤坏死因子（TNF-α）是重要的炎症介质，实验结果证实CSE也能增加能TNF-α的表达。有证实CSE诱导的TNF-α能增加MUC5ACmRNA表达，其机制可能是通过TNF-α－TGF-α/双向调节因子－EGFR－MUC5AC通路增加后者的表达。TNF-α

/双向调节因子stimulatorTomaszK.Baginski;AmericanJournalofRespiratoryCellandMolecularBiology.人转化生长因子

CompanyLogo讨论有研究认为，HSP70能通过上调细胞TNF-α合成发挥其生物学作用。因此，我们推测HSP70可能通过调节TNF-α合成影响气道黏液分泌。即存在CSE-HSP70-TNF-α－TGF-α/双向调节因子－EGFR