基因工程与常用的分子生物学技术生物化学课件

基因工程与常用的分子生物学技术作者:邵世滨单位:生物化学教研室生物化学常用分子生物学技术及应用生物化学

核酸原位杂交是用序列已知的、特定标志标记过的核酸作为探针，与细胞或组织切片中的核酸碱基互补配对进行复性杂交，形成专一的杂交分子，通过探针上的标记将待测核酸在细胞、组织中的位置显示出来。该方法不需从组织或细胞中提取核酸，有很高的灵敏度，并可保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。一、核酸原位杂交探针(probe)2.理想探针的特点

(1)带有标记的示踪物，便于检测、鉴定；

(2)应是单链；

(3)具有高度特异性；

(4)探针长度一般为数十至数千个碱基;(5)具有高灵敏度和稳定性，标记方法简便安全。1.

探针是一段与被测的核苷酸序列(靶基因序列)互补的带有标记的核苷酸片段。二、聚合酶链式反应（一）工作原理1.定义聚合酶链式反应是在体外将微量的目的基因片段大量扩增，以得到足量的DNA供研究分析和检测鉴定用的技术。PCR技术的基本原理与体内DNA的复制过程相似2.PCR有三个反应步骤DNA的变性DNA与引物的退火(复性)引物的延伸。n个循环加热变性模板DNA退火DNA延伸P25′

3′5′

3′5′

3′

3′P15′

变性→复性→延伸这三个步骤为一个循环，每次循环的产物作为下个循环的模板，如此循环多次，则DNA成指数扩增。5’3’5’3’5’3’5’引物加热变性3’5’5’3’5’3’5’3’EcoRⅠ5’退火3’3’DNA聚合酶、4种dNTP3’5’3’5’3’3’5’5’延伸3’5’5’5’3’3’加热变性退火5’3’3’5’3’5’5’3’延伸①21②22n2nDNA聚合酶、4种dNTP延伸DNA聚合酶、4种dNTP延伸5’EcoRⅠ（二）PCR衍生技术及应用1.原位PCR在组织细胞里进行PCR反应，将扩增的目的片段在组织细胞中定位。2.多重PCR是在同一PCR体系中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域，或不同的目的基因。

3.逆转录PCR将RNA链逆转录成为cDNA，再以此为模板通过PCR进行目的基因的扩增。4.荧光定量PCR是在PCR在扩增时除了加入引物还加入特异性的荧光探针。

三、印迹技术印迹技术是以凝胶分离生物大分子后，将之直接放在或转移至固定化介质上加以检测分析的技术。包括DNA印迹技术、RNA印迹技术和蛋白质印迹技术（一）Southern印迹杂交Southern印迹杂交（Southernblot）即DNA印迹技术用限制性核酸内切酶消化DNA，得到诸多片段，经琼脂糖凝胶电泳分离后，将胶上的DNA片段变性并原位转印到尼龙膜等固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定。用带有标记的DNA探针与这些片段进行杂交后显影或显色。通过条带的有无或深浅来进行DNA的定性与定量。基本过程提取重组DNA限制酶切割变性1.制备待测核酸2.探针的制备与目的基因高度特异，可用化学合成的方法3.杂交①转膜②杂交薄膜探针③洗涤④检测限制性核酸内切酶酶切全长DNADNA片段琼脂糖凝胶电泳分离了DNA片段的凝胶硝酸纤维素膜吸附有DNA片段的膜转膜杂交显影带标记的DNA探针Southern印迹杂交基本流程（二）Northern印迹杂交Northern印迹杂交（Northernblot）即RNA印迹技术。技术原理与Southern印迹杂交一致。Northern印迹杂交通过检测RNA的量来研究基因的表达情况。（三）Western印迹法Western印迹法（WesternBlot）即蛋白质印迹技术与Southern或Northern杂交方法类似，但电泳的介质是聚丙烯酰胺凝胶，被检测的是蛋白质，“探针”则是抗体，用带标记的抗一抗的抗体（二抗）显色。通过分析条带位置和着色深度检测目的蛋白质在组织细胞中的表达情况。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离了蛋白质的凝胶硝酸纤维素膜吸附有DNA片段的膜转膜杂交显色Western印迹杂交基本流程变性一抗二抗2.特点

针对性强、特异性强、灵敏度高、适应性强。四、分子生物学技术的临床应用1.基因诊断是指利用分子生物学技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。(一)基因诊断(genediagnosis)

3.应用遗传性疾病肿瘤感染性疾病遗传易感性疾病器官移植配型法医学中个体识别、亲子鉴定1.

基因治疗是指以正常基因矫正、替代缺陷基因，或从基因水平调控细胞中缺陷基因表达的一种治疗疾病的方法。2.狭义的基因治疗是指将目的基因导入靶细胞，与宿主细胞的基因整合后表达以达到治疗疾病的方法。3.

广义的基因治疗是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用以达到治疗疾病的方法。

(二)基因治疗(genetherapy)5.基因治疗的基本程序(1)选择和制备目的基因：治疗性基因。(2)选择基因转运载体：通常选择病毒载体。(3)选择靶细胞：体细胞、生殖细