T-GRHA 0001-2024 基于FFPE 样本的非小细胞肺癌相关基因突变高通量测序检测方法

ICS11.020CCSC50 GRHAThehigh-throughputsequencingmethodfordetectingnon-smalcancer-associatedgenemutationsbasedonFFIT/GRHA0001—2024前言 2规范性引用文件 3术语和定义 4缩略语 35实验室分区、仪器设备及试剂 36检测内容和范围 47样本采集、保存及运输 68检测实验步骤 69数据处理和分析 810性能确认 911质量控制 附录A（规范性）采样方式和注意事项以及FFPE样本准备、保存与运输条件 12附录B（资料性）申请单模板与送检须知示例 15参考文献 T/GRHA0001—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由广东省呼吸与健康学会提出。本文件由广东省呼吸与健康学会归口。本文件起草单位：广州金域医学检验集团股份有限公司、广州呼吸健康研究院、中山大学附属第一医院、暨南大学附属第一医院、广州金域医学检验中心有限公司、广州迈景基因医学科技有限公司、哈尔滨医科大学附属第四医院、北京大学深圳医院、广东省第二人民医院、中国人民解放军第九六二医院、南京世和基因生物技术股份有限公司、北京吉因加、深圳市第二人民医院、延边大学附属医院、长沙市中医医院、常德市第一人民医院、中国航天科工集团七三一医院、中国医科大学附属第一医院、大连市理工大学附属中心医院、朝阳市第二医院、广州中医药大学深圳医院（福田）、河南科技大学第一附属医院、齐齐哈尔医学院附属第三医院、互助土族自治县中医院、云南曲靖市第一人民医院、云南省昭通市中医医院、德宏州人民医院、武汉大学中南医院、台州市中心医院、洛阳市中心医院、烟台毓璜顶医院、安阳市人民医院、郑州市第三人民医院（郑州市肿瘤医院）、驻马店市第一人民医院、贵州省人民医院、贵州省黔南州人民医院、贵州市第二人民医院、六盘水市人民医院、黔西南布依族自治州人民医院、都匀市人民医院。本文件主要起草人：祁德波、周承志、柯尊富、陆元志、蔡小强、常凤启、牟文博、程雅婷、邓泱泱、李梦真、才旭、路德娟、吴晓红、栾嵩、孙瑞琳、杨家盛、赵守焱、申健、张秀艳、易玉婷、王佳威、莫南勋、刘向前、李维、张敏、苏炜欣、张松男、孙妲、邹孔军、杜维、刘庆、成尚涛、相科羽、吴志军、闵先军、孔德磊、汪洋、姚冬梅、张智伟、毛毅敏、石寒冰、牟海军、姜云飞、石大泉、白文琴、李宏伟、付玉东、鲜昌毅、钱俊、余露、陈保富、卢洪胜、黄建伟、赵琪、刘杰、王永亮陈露、孔天东、李林野、彭春红、叶贤伟、吴熙、方银、黎莉、肖霄、梁伟、朱文煜、龙秀、李林、孔伟英、琚桂平。1T/GRHA0001—2024基于FFPE样本的非小细胞肺癌相关基因突变高通量测序检测方法本文件规定了采用高通量测序技术对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本进行非小细胞肺癌（NSCLC）相关基因突变的检测方法和操作流程，以及性能确认和质量控制等。本文件适用于临床医学领域中涉及高通量基因测序项目研发和应用的医疗卫生机构、第三方检测机构、技术研发企业等。本文件适用于拟接受靶向治疗的浸润性腺癌或含腺癌成分的NSCLC患者，包括IB-IIIA期术后和IIIB期以上晚期患者。经活检组织病理学确诊为鳞癌的晚期NSCLC患者携带可靶向的驱动基因机率较低，可选择检测。使用来源于其肿瘤组织的FFPE样本，检测具有靶向治疗药物的驱动基因变异并作为用药指导。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T30989—2014高通量基因测序技术规程GB/T35890—2018高通量测序数据序列格式规范GB/T42216.3—2022/ISO20166—3:2018分子体外诊断检验福尔马林固定及石蜡包埋组织检验前过程的规范T/GDPMAA0011—2022医疗机构分子病理实验室建设规范T/GDPMAA0012—2023高通量基因测序项目分类3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1高通量测序High-throughputsequencing又称为二代测序（Next-generationsequencing，NGS），能够一次对大量核酸分子进行平行序列测定，通常一次测序反应能产出数百万至数亿条核酸片段的测序数据。[来源：GB/T30989—2014，定义3.19，《高通量基因测序技术规程》，参考并修改]3.2非小细胞肺癌Non-smallcelllungcancer;NSCLC非小细胞肺癌（NSCLC）是除小细胞肺癌（SCLC）以外、所有来源于肺上皮的各种类型癌症的集合体；常见类型有鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等。NSCLC的发生率占肺癌总发生率的80%-85%，如果没有特别说明，肺癌指代非小细胞肺癌。[来源：国家卫生健康委肿瘤和血液病相关病种诊疗指南（2022年版《原发性肺癌诊疗指南（2022年版）》，参考并修改]3.3福尔马林固定石蜡包埋Formalin-fixedparaffinembedded;FFPE一种在组织学和病理学领域中常用的技术，用于制备组织样本以供显微镜下观察分析和组织保存。这个过程通常分为三个主要步骤：固定（用标准中性福尔马林溶液处理样本使其稳定）、脱水（将固定2T/GRHA0001—2024后的组织浸泡在一系列浓度梯度不断增加的脱水试剂溶液中，最后用无水溶液处理，从而去除组织中的水分）、包埋（将脱水后的组织样本放入熔化的石蜡中制成蜡块，以便可以制作切片用于后续处理）。[来源：GB/T42216.3-2022/ISO20166-3:2018，《分子体外诊断检验福尔马林固定及石蜡包埋组织检验前过程的规范》，参考并修改]3.4引物Primer引物是指在DNA复制过程中，结合于模板链上并作为复制延伸的起始位点的具有一定长度和顺序的寡核苷酸链。[来源：T/GDPMAA0012—2023高通量基因测序项目分类，参考并修改]3.5扩增子测序Ampliconsequencing使用多对引物进行的PCR反应对目标序列进行扩增，并对产生的核酸产物进行高通量测序。[来源：T/GDPMAA0012—2023高通量基因测序项目分类，T/GDPMAA0011-2022医疗机构分子病理实验室建设规范，参考并修改]3.6探针捕获Probecapture探针捕获是指通过设计合成有效的特异性探针，与待测样本中的基因组DNA进行杂交，从而将含有靶序列的DNA片段进行分离和富集，并用于高通量测序。[来源：GB/T30989—2014，定义3.5，《高通量基因测序技术规程》，参考并修改]3.7文库Library通过生物来源的、人工合成的或克隆技术等获得的一个重建分子群，如基因组文库、互补DNA文库、噬菌体展示肽文库等。[来源：GB/T30989—2014，定义3.5，《高通量基因测序技术规程》]3.8测序覆盖率Coveragerateofsequencing参考序列目标区域中被样本测序序列覆盖的比例（测序覆盖率=目标区域内测序序列覆盖长度÷参考序列目标区域非N碱基总长度）。[来源：GB/T30989—2014，定义3.30，《高通量基因测序技术规程》，参考并修改]3.9测序深度Depthofsequencing待测样本中某个指定的核苷酸被检测的次数。[来源：GB/T30989—2014，定义3.31，《高通量基因测序技术规程》]3.10碱基识别质量Qualityofbasecalling评价碱基准确识别的概率。简称为Q，通常以数值表示，定义为Q=-10log10P。碱基识别质量值与碱基识别错误率负相关，二者遵循对数函数关系。碱基识别质量值越高，错误率越低。如Q30指测序数据中，碱基识别质量值为30的碱基识别准确率为99.9%，或错误率为0.1%。[来源：GB/T30989—2014，定义3.29，《高通量基因测序技术规程》]3.11参考序列Referencesequence测序片段对应的物种基因组序列。[来源：GB_T35890-2018，定义3.11，《高通量测序数据序列格式规范》]3.12变异Variation样本中和参考序列不一致的核苷酸碱基序列，包括单核苷酸变异、插入型变异、缺失型变异、插入缺失型变异、拷贝数变异、融合基因变异等。[来源：T/SZGIA4-2018，定义3.6，《临床单基因遗传病基因检测报告规范》，参考并修改]3T/GRHA0001—20243.13单核苷酸变异Singlenucleotidevariation简称SNV，在基因组DNA上某一位置的单个核苷酸碱基发生改变。[来源：T/SZGIA4-2018，定义3.7，《临床单基因遗传病基因检测报告规范》，参考并修改]3.14插入/缺失变异Insertion-deletionvariation插入变异指在基因组DNA的某个位置上发生的小片段序列的插入，插入片段的长度在50bp以下。缺失变异指在基因组DNA的某个位置上发生的小片段序列的缺失，缺失片段的长度在50bp以下。插入缺失型变异简称Indel，在基因组DNA的某个位置上发生缺失的同时又有新的核苷酸碱基插入，发生改变的片段长度在50bp以下。[来源：T/SZGIA4-2018，定义3.8，《临床单基因遗传病基因检测报告规范》，参考并修改]3.15拷贝数变异Copynumbervariation简称CNV，一般指长度为1kb以上的基因组大片段的拷贝数增加或者减少，通常由基因组内的部分区域发生结构重排而导致。[来源：T/SZGIA4-2018，定义3.11，《临床单基因遗传病基因检测报告规范》，参考并修改]3.16基因融合Genefusion由于染色体水平上发生结构变化，导致两个不同基因的部分序列或全部序列发生连接，形成一个新的基因。新的融合基因可能具有不同的结构和功能，可以导致异常细胞信号传导和增殖，从而促进肿瘤的发展。[来源：T/GDPMAA0012—2023，《高通量基因测序项目分类》；T/SZGIA4-2018，定义3.8，《临床单基因遗传病基因检测报告规范》，参考并修改]4缩略语下列缩略语适用于本文件。CNV：拷贝数变异（Copynumbervariation）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）FFPE：福尔马林固定石蜡包埋（Formalin-fixedparaffinembedded）Indel：插入或缺失型变异（Insertion-deletionvariation）NGS：高通量测序/二代测序（High-throughputsequencing/Next-generationsequencing）NSCLC：非小细胞肺癌（Non-smallcelllungcancer）PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction）Post-PCR：PCR及PCR后处理Pre-PCR：PCR前处理RNA：核糖核酸（Ribonucleicacid）RNase：核糖核酸酶（Ribonuclease）SNV：单核苷酸变异（Singlenucleotidevariation）UTR：非编码区（Untranslatedregion）5实验室分区、仪器设备及试剂5.1实验室分区5.1.1分区原则对于开展NGS检测的实验室，因其灵敏度高的特点，实验室应采取适当预防措施，避免交叉污染，最大限度降低污染导致假阳性结果的风险。应根据Pre-PCR和Post-PCR阶段的不同工作内容划分独立区域，并有明显标志。针对NGS检测实验室中使用RNA作为起始样本，RNA提取与RNA建库前准备需要严格分区，并保证无RNase污染，防止RNA的降解。4T/GRHA0001—20245.1.2实验室分区实验室应当设置以下区域：样本前处理区、试剂储存和准备区、样本制备区、文库制备Ⅰ区（扩增子建库扩增完成后开盖前的操作；杂交捕获法全基因组文库制备）、文库制备Ⅱ区（扩增子建库扩增完成后开盖后的连接或者二次扩增；杂交捕获法杂交和二次扩增）、测序和分析区。各区域在物理空间上必须是完全相互独立的，无论是在空间上还是在使用中，应当始终处于完全分隔状态，不能有空气直接相通。根据使用仪器的功能，区域可根据实际情况适当合并。5.1.3分区要求实验室的空气流向或者通风应作为实验室防污染的强制要求，工作流程和空气流向按照单一方向进行，应按照试剂储存和准备区→样本制备区→文库制备区→测序和分析区进行，防止扩增产物顺空气气流进入扩增前区域，可通过安装排风扇、负压排风装置或其他可行的方式实现。各区所属仪器和耗材应专用，所用的器材（如移液器和吸头）不可混用。5.2仪器设备及试剂5.2.1仪器设备宜包含以下仪器设备：a)组织脱水机；b)医学显微镜；c)生物安全柜(Ⅱ级或Ⅱ级以上）；d)二代测序仪；e)PCR仪；f)核酸超声波打断仪；g)冷冻离心机（最大离心力12000g以上）；h)微量移液器；i)酶标仪；j)定量荧光计（可配合荧光染料检测试剂快速完成核酸浓度的读取，最低应能检测0.2ng/μL的核酸样本）；k)核酸片段分析仪；l)涡旋器；m)振荡器；n)核酸纯化仪；o)破碎仪（匀浆仪、均质器）；p)孵育器；q)核酸蛋白定量仪；r)冰箱（4℃、-20℃低温和-80℃超低温）；s)高性能生物信息学分析服务器。5.2.2试剂宜包含以下试剂：a)核酸提取试剂；b)PCR扩增引物；c)捕获探针；d)PCR产物纯化试剂；e)文库制备试剂：试剂盒内至少应包含连接头、连接酶、聚合酶、缓冲液；f)二代测序试剂：试剂盒内至少应包含测序引物、高效测序反应酶、缓冲液；g)测序芯片。6检测内容和范围5T/GRHA0001—20246.1检测的基因和变异类型6.1.1检测范围内基因和变异的确定依据参考国内外肺癌相关指南和专家共识，应至少检测与NSCLC发生和发展密切相关，并且与靶向治疗密切相关的基因和特定基因变异，同时宜根据最新研究进展，包含具有潜在临床意义和靶向治疗方法的基因和特定基因变异。6.1.2NSCLC相关基因和基因组区域宜纳入检测的NSCLC相关基因及基因组区域：b)检测内容应至少覆盖NSCLC诊疗中具有明确临床意义的变异位点：EGFRL858R、EGFREx19del、EGFRT790M、EGFREx20ins、EGFRS768I/L861Q/G719X/C797S、KRASG12C、BRAFV600E、ERBB2Ex20ins、ERBB2Amplification、METEx14Skipping、METAmplification、ALK/ROS1/RET/NTRK1/NTRK2/NTRK3fusion、ALKG1202R/L1196M、ROS1G2032R/L2086F、NTRK1G595R、NTRK3F617L/G623R/G696A；c)检测范围可以包括具有潜在临床意义的扩展基因及其变异位点，同时扩展核心基因罕见位点检测。如KRAS基因第2、3号外显子热点突变，NSCLC癌症通路相关基因，免疫治疗相关基因，靶向药物耐药相关基因等；d)如果需评估肿瘤突变负荷（TumorMutationBurden，TMB）用于指导免疫治疗，则靶向测序Panel覆盖范围原则上不应少于300个基因，覆盖基因组序列区域不宜<1.0Mb，并建议与外显子组测序（WES）评估的TMB进行一致性评价；e)基因组区域应包括但不限于基因的编码区、UTR区以及内含子区发生的已知热点突变或热点融合断点区域等。6.1.3NSCLC相关变异类型检测变异类型应包括SNV、Indel、CNV以及重排/融合基因。特定基因变异：与非小细胞肺癌密切相关的特定的基因变异，包括但不局限于DNA检测基础上的SNV、Indel、CNV变异或染色体易位、中间缺失或染色体倒置等原因形成的融合基因等。6.2检测方法设计6.2.1基本要求鉴于DNA和RNA样本特性及可检测变异类型的差异，二者需区别对待。鉴于NGS技术流程复杂，检测实验室需根据自身能力选择以下合适的技术路线：a)基于DNA水平的NGS（DNA-basedNGS）可用于检测NSCLC相关基因的各种变异类型，包括SNV、Indel、CNV、染色体易位等，通过多重PCR方法或探针捕获方法对相应基因组DNA片段进行富集。设计前，检测实验室需充分了解多重PCR法和探针捕获法的优势和局限性，明确该检测产品所采用的技术及所覆盖的变异类型；b)基于RNA水平的NGS（RNA-basedNGS）可用于检测NSCLC相关融合基因变异、可变剪切、编码区SNV、Indel以及基因表达水平等。RNAseq分为靶向RNA测序和全转录组测序；靶向RNA测序可选择多重PCR方法或探针捕获方法，对临床样本中表达后的基因进行检测；c)检测实验室需要对靶向RNA测序和全转录测序的优缺点进行充分了解，选择适合该实验室的技术路线并对该方法做严格验证；如选择靶向RNA测序的方法，则需充分了解多重PCR方法和探针捕获方法在基因融合检测中的优势和局限性，并明确该检测产品所覆盖的变异类型。6.2.2多重PCR方法的引物设计引物设计需依据以下原则：a)每个特定变异应设计至少1对扩增引物，特定基因变异的扩增序列特异性要高，引物长度一般为18至24个碱基，各引物之间不能互补，应避免非特异性扩增或引物二聚体；6T/GRHA0001—2024b)多重PCR的反应体系也会影响扩增效果，体系中的各组分需满足每对引物对应靶点的扩增量要c)为了保证扩增产物产量尽可能一致，应尽可能选择有利于较长片段扩增的反应条件；d)每个特定变异的扩增子需要通过标准品或阴性/阳性样本进行验证；e)扩增子检测的特定基因变异包括但不局限于EGFRT790M等变异。6.2.3探针捕获方法的探针设计探针设计需依据以下原则：a)每个基因/变异区域应设计一定数目的捕获探针进行覆盖，捕获探针通过与基因组DNA进行杂交，将目标区域进行捕获并富集，然后通过主流二代测序平台进行高通量测序；b)捕获探针数量取决于所捕获的基因/变异区域大小以及探针覆盖策略（TilingStrategy，具体含义就是目标区域中每个碱基位点被多少条不同的探针覆盖探针重叠区域为每个探针之间的重叠碱基数目，重叠区域越大，目标区域覆盖率越高，但测序成本则越高；重叠区域越小，甚至探针间隔分布，目标区域覆盖率越低，测序成本则越低；c)受捕获特异性等各种因素的影响，捕获探针设计应综合考虑探针类型、重叠测率、长度以及捕获区域序列特性等因素，并进行实验条件摸索来获得最佳参数组合。需要注意的是，由于基因组中存在高GC、重复序列等复杂结构，有些区域可能因探针设计困难而较难捕获。7样本采集、保存及运输7.1基本要求样本类型为来源于非小细胞肺癌患者肺部或转移部位肿瘤组织的FFPE样本。样本采集应遵循以下原则：采集肺部肿瘤组织并尽可能减少非肿瘤组织干扰；样本进行FFPE处理过程中，应避免样本间交叉污染；及时处理和送检。采样注意事项以及FFPE样本准备、保存与运输条件详见附录A。7.2样本验收标准具体验收标准如下：a)样本来源：主要包括手术、支气管镜和胸腔镜下活检、CT引导下肺穿刺、淋巴结穿刺活检等方法获取的样本。活检或手术样本需要及时固定，一般要求离体样本需在60分钟内固定，如不能及时固定的样本需置于4℃环境中，以避免核酸降解影响检测结果；b)样本温度：应室温或冷藏运输；c)样本外观：FFPE蜡块或切片，白片或蜡卷数量应根据切片厚度和组织大小适当增减。切片需使用独立刀片，在干净容器及水池中独立捞片与贴片；d)样本大小：肿瘤组织应满足规定的大小，用于分子检测的穿刺样本应≥1条，长度≥0.5cm；e)肿瘤含量：肿瘤细胞占比应满足检测要求即≥20%。若肿瘤细胞含量较低，可通过富集以保证检测结果的准确可靠；f)样本信息：要求样本有对应的填写完整的检测申请单、送检须知等。申请单应涵盖但不限于以下信息：受检者姓名、年龄、性别、送检医院、样本类型、检测项目、样本采集时间、样本送检时间、临床初步诊断、病理诊断等（申请单与送检须知示例详见附录B）。8检测实验步骤8.1基本要求实验所用试剂和方法可分为两种情况：a)使用商品化试剂盒：当使用专用于样本处理、核酸提取、文库构建和高通量测序的商品化试剂盒时，应遵循制造商的使用说明；b)使用实验室自建程序：当实验室使用不同于商品化试剂盒的自建程序时，则应确认它符合检测目的，并编写说明且遵守。使用不同制造商的商品化试剂盒可能影响结果，且不同产品可能不7T/GRHA0001—2024兼容。只有在各组件经过配套测试并经过确认符合检测目的和要求时，才可将其应用于正式检测流程。8.2样本前处理以及核酸提取8.2.1样本前处理样本在提取核酸前，首先检查验收样本合格，并且确认肿瘤细胞含量满足检测质控要求（建议≥20%8.2.2FFPE样本核酸提取选择适用于FFPE样本的核酸提取试剂盒，手动或使用全自动核酸提取仪对样本进行核酸提取。8.2.3核酸浓度测定使用核酸蛋白定量仪测定并且记录核酸浓度。8.2.4核酸质量评估和保存核酸质量评估：提取后应对核酸质量进行评估，评估指标可选择评估完整性、浓度、纯度等，具体评估哪些指标应根据所使用建库试剂和方法对核酸的要求而设定，以利于后续的检测实验为基本原则进行选择。常用指标包括OD230/260/280的吸光度、核酸片段长度、RNA完整值（RIN）以及DV200等。核酸保存：由于DNA和RNA的化学结构和稳定性存在差异，其保存条件应独立设置。DNA应保存在含有Tris-HCl成分的缓冲液中，可在4℃的环境中短期保存（1个月内），在-20℃的环境中长期保存（数个月到数年）。RNA应保存在在无核酸酶水中，使用无核酸酶的耗材进行盛装，可在-20℃的环境中短期保存（1个月内），在-80℃的环境中长期保存（数个月到数年），如有必要还可添加RNA稳定剂以降低RNA的降解程度，进一步延长RNA的保存期。8.3文库构建8.3.1文库构建的方法文库构建主流的方法包括扩增子建库法和液相杂交捕获法。a)扩增子建库法：1)以DNA样本为建库模板时，使用特异性引物直接对基因组DNA中目标区域进行多重PCR扩增，并通过PCR或连接的方式将与二代测序平台相匹配的接头和区分样本的测序标签添加至目标序列，以制备成文库；2)以RNA样本为建库模板时，先将RNA进行逆转录得到cDNA（使用随机引物或特异性引物取决于具体的应用目的），然后使用特异性引物直接对cDNA中目标区域进行多重PCR扩增，再通过PCR或连接的方式将与二代测序平台相匹配的接头和区分样本的测序标签添加至目标序列，以制备成文库；由于使用特异性引物进行扩增时特异性较高，对RNA样本进行核糖体RNA和/或珠蛋白mRNA的去除步骤并不是必须的，具体是否需要主要根据整体检测方法对灵敏度、特异性等的要求和目标而确定。b)液相杂交捕获法：1)以DNA样本为建库模板时，将基因组DNA片段化后进行片段末端修复、补平和加上末端碱基，与二代测序平台相匹配的接头和区分样本的测序标签连接，并针对目标区域进行液相杂交捕获和扩增，以制备成文库；2)以RNA样本为建库模板时，需先将RNA制备成片段化的双链cDNA序列，该过程中包括逆转录、片段化、一链/二链生成等多个过程，这些过程的具体顺序和操作流程取决于检测方法所采用的建库试剂；接下来添加末端碱基，连接与二代测序平台相匹配的接头和区分样本的测序标签，并针对目标区域进行液相杂交捕获和扩增，以制备成文库；对于组织样本来源的RNA，全转录组测序通常需要对核糖体RNA进行去除，而靶向RNA测序则不是必须的，具体操作需要根据整体检测方法对灵敏度、特异性等的要求和目标而确定。8.3.2文库质量控制8T/GRHA0001—2024文库构建后需对其进行质量控制，质控合格后才可以进行测序，质控指标应至少包括文库浓度（摩尔浓度或质量浓度）、文库片段大小和其它指标。对文库进行质量控制时具体使用的仪器或者方法取决于所采用的建库试剂对文库的要求。8.4高通量测序进行测序时应注意：a)选择合格的文库、高通量测序试剂以及高通量测序平台，根据测序仪厂商提供的标准测序流程进行测序操作；b)测序完成后，应对文库质量和测序数据进行统计和评估，确保样本的DNA浓度、DNA片段大小、DNA文库定量、测序数据量和质量（如Q30值）符合性能确认阶段所确定的标准。9数据处理和分析9.1生物信息学分析流程在对测序数据进行具体的生物信息分析之前，需先对下机数据进行数据完整性校验。然后将完整测序得到的序列数据通过预处理、序列比对、变异检测、变异注释和质量控制分析等一系列过程，生成包括原始测序序列FASTQ文件、待分析序列SAM/BAM文件、原始变异结果VCF文件、以及变异注释和质量报告在内的生信分析结果。分析流程应明确所用人类参考基因组版本，并在整个分析流程中使用基因组版本一致的数据库或数据文件。分析流程所包含工具和参数应当与性能确认流程保持一致，分析方法及参数的变更需重新进行性能确认并进行文档记录。9.2测序数据质量控制应根据性能确认阶段所确认的检测性能参数对生信分析的质量报告结果进行质量控制（QC确保质量合格后方可进行后续医学分析和报告。对于测序仪下机数据，应使用测序仪厂商提供的具体测序平台的质量控制指标；对于检测样本数据，应使用表1中建议的质量控制指标。表1检测样本数据建议质量控制指标9T/GRHA0001—2024表1检测样本数据建议质量控制指标（续）最低检测限（LOD）设定该指测限为变异频率不小于5%的域中测序深度不低于100X的区域中覆盖深度不低于50X、去除低质量、重复序列后用于生信数据分析的序10性能确认10.1方案选择临床实验室可参考CNAS-CL02《医学实验室质量和能力认可准则》选择性能验证方案或性能确认方10.2性能验证按照相关标准、制造商说明书或作业指导书规定的方法对实验方法进行性能验证。10.3性能确认时机性能确认应在以下情况下进行：a)仪器在投入使用前应通过性能确认。仪器搬迁、仪器故障维修后、仪器更新升级，应重新进行确认；b)核酸提取试剂、PCR产物纯化试剂、文库构建试剂、二代测序试剂等试剂在使用前应通过性能确认。更换试剂品牌前，应重新进行确认；c)核酸提取、文库制备等方案流程的确定前应通过性能确认。更换方案前，应重新进行确认；d)数据库建立和生信分析流程应用前应通过性能确认。数据库更新以及在原有检测基因和变异类型基础上增加新的基因和变异类型并扩大检测范围后，应重新进行性能确认。T/GRHA0001—202410.4测序平台的性能确认依据检测项目及临床预期用途，综合考虑测序读长和通量、测序准确率、运行时间、测序成本等选择测序平台。安装时，由厂方工程师按照说明书所注明的仪器性能指标逐项验证，达到广方声称的指标并满足临床预期用途为合格。10.5生物信息分析平台的性能确认实验室可以选择商业化的自动分析系统，或者根据检测项目和预期用途选择合适的算法和软件，搭建本实验室的生物信息学分析流程，并进行必要的性能确认（最低测序数据量、准确度、灵敏度、特异性、精密度、最低检测限等），以保证对相关基因和突变类型的检测准确性。应使用阳性临床样本进行全流程检测，并结合计算机数据模拟变异的方式，进行生物信息分析平台的性能确认。10.6分析性能确认10.6.1准确度/灵敏度/特异性对于定性分析，准确度、灵敏度和特异性是指与比对试验或者标准方法检测结果的相关性。可以选择以下两种不同类型的样本来进行分析性能确认：a)使用标准参考品。使用已知突变信息（基因、变异、变异比例）的商业化标准参考品进行分析性能确认，评价定性检测的准确度、灵敏度和特异性；b)使用真实临床样本。选择阳性临床样本，该临床样本应已经过参比方法的验证，参比方法可以为金标准方法、行业公认方法、经验证性能符合要求并满足临床预期用途的方法等。选取样本的数量需要具有统计学意义，建议至少59例样本。比较检测结果与参比方法之间的差异，不一致的结果再用其它方法进一步验证，通过阳性符合率和阴性符合率评价定性检测的准确度、灵敏度和特异性。10.6.2精密度精密度包括同一批样本用同一种方法和同一种仪器的重复性精密度，以及不同时间、不同操作人员、不同仪器（相同型号）、不同实验批次之间的再现性精密度：a)对同一批样本在同一条件下（相同的环境、操作人员及仪器）应至少进行3次以上检测，评价重复性精密度；b)对不同时间、不同操作人员、不同仪器（相同型号）应至少进行3次以上检测，评价再现性精密度；c)重复性精密度和再现性精密度评价各自的重复检测次数至少3次，可在实验流程中安排同时进d)建议使用变异比例为3倍LOD左右（即2~4倍LOD之间）的阳性样本进行精密度实验，不同变异类型应至少使用1例样本进行精密度验证实验，评价精密度的指标包括阴阳性符合率、变异系数（CV）等。10.6.3最低检测限在分子检测领域，最低检测限是指用该项分子测试技术能够测到生物样本中待测靶核酸分子的最低含量。实验室应建立不同样本类型、不同变异类型的最低检测限。通常选择混合参考品（定值标准物质）并进行梯度稀释和检测，计算出最低检测限值。生信分析方法应以标准参考品和真实临床样本为主要验证对象，对分析流程的准确度、灵敏度、特异性、精密度、最低检测限等进行充分验证。当真实临床样本数量不足时，需要通过模拟数据验证分析流程的理论极限值。11质量控制11.1室间质量评价检测机构应参加相应的实验室室间质评项目，当无实验室室间质评项目可利用时，可通过与其他实验室比对（即室间比对）的方式确定检验结果的可接受性。实验室应规定比对实验室的选择原则（如已T/GRHA0001—2024获认可的实验室、使用相同检测方法的实验室）、样品数量（应包括正常和异常水平）、频率、判定标准等。实验室负责人或指定人员应监控室间比对活动及其结果，并在结果报告上签字。11.2室内质量评价11.2.1基本要求每次实验应设置阴性质控物和阳性质控物。11.2.2阴性质控物用于识别外部污染、试剂污染或样本间交叉污染。11.2.3阳性质控物为含有一种或多种检测范围内基因和变异类型的样本，用于监测检验过程是否正常和满足质控要求。11.2.4环境质控实验室还应定期进行室内环境内和设备上的污染物的检测，对环境和设备进行采样，使用荧光定量PCR或者该实验室正在开展的NGS检测方法均可。应至少每月进行1次检测。如发现环境内、设备上存在污染物，应立即对实验室进行彻底清洁，包括但不限于地板、桌面、墙壁、天花板、设备表面、设备与实验耗材或试剂接触的部位等。T/GRHA0001—2024（规范性）采样方式和注意事项以及FFPE样本准备、保存与运输条件A.1采样方式和注意事项A.1.1肿瘤组织采集临床采集样本时应剔除坏死、出血、黏液和钙化组织。样本获取过程可导致出血、气胸等一系列并发症，且样本需经固定、石蜡包埋、H&E染色、免疫组化及显微镜镜检等步骤明确诊断，多个步骤会消耗较多样本，为有足够样本进行后续基因检测，在尽量避免并发症的同时，应尽可能在精准前提下多获取样本。A.1.2根据病变的位置和类型的不同，可采用以下几种采样方式。A.1.2.1经气道活检样本经气道活检样本采样方式如下：a)支气管镜可视气道内病变。对于镜下所见新生物活检时，如无特殊情况，5块活检样本可满足病理免疫组织化学染色及基因检测需要。活检时应取材良恶交界处，避免活检坏死区域。建议使用第2、3块活检样本涂片，行快速现场评价，明确样本质量，必要时增加活检次数；b)支气管镜不可视气道内病变。与支气管相通肺外周病变患者行活检时，建议应用X线透视、电磁导航、虚拟导航、径向支气管内超声、超细支气管镜、快速现场评价等手段，以提高诊断阳性率，增加取材量；c)气管、支气管腔外病变。对于气管、支气管腔外病变，推荐经支气管针吸活检（TBNA）、支气管腔内超声引导经支气管针吸活检（EBUS-TBNA）、支气管腔内超声引导经支气管活检钳活检（EBUS-TBFB）及支气管腔内超声引导经支气管冷冻活检（EBUS-TBMC尤其推荐后两种方法，获取样本量更大。样本获取后建议进行快速现场评价，以评估样本中肿瘤细胞数量及质量；d)不与气道相通肺内病变。尤其肺外周病变，建议选择影像引导经皮肺活检，活检前可行PET-CT、增强CT等检查，明确病灶有活性部位，避免活检肿瘤坏死区域，影响检测结果。活检后建议行快速现场评价，以评估样本中肿瘤细胞数量及质量。A.1.2.2经皮壁层胸膜活检样本部分肺部恶性肿瘤患者需取材于胸膜转移灶，可选择超声引导经皮壁层胸膜活检、CT引导经皮壁层胸膜活检及内科胸腔镜下壁层胸膜活检，其中胸腔镜下壁层胸膜活检推荐冷冻活检，取材样本量大。活检后均建议行快速现场评价，以评估样本中肿瘤细胞数量及质量。A.1.3支气管镜下肺癌组织样本和细胞学样本常见的取材方式包括活检钳活检、支气管刷检和肺泡灌洗，应分别按照以下要求和注意事项进行。A.1.3.1活检钳活检操作前应核查患者各项检查结果，制订完整的手术计划。钳取标本前应吸除支气管内分泌物，窥清病变部位。对支气管腔内可视病灶，活检时宜在肿瘤与正常黏膜交界处取标本，不要在坏死明显部位取标本。对管壁浸润或增厚者，可在病变黏膜下注射少量生理盐水，使病变组织隆起，更利于取材。在病情允许的情况下，至少行3～4次活检，以保证所得肺组织样本能够进行病理及分型诊断、分子学诊断等用途。A.1.3.2支气管刷检T/GRHA0001—2024支气管刷检推荐使用一次性细胞刷，以避免交叉污染和感染的发生。可在活检部位刷取，以提高阳性率。对于在直视下仅见一些非特异性改变或未见异常者，应在相应的部分先行刷检，然后再行钳检，以免钳检后出血，影响视野，或刷片有较多红细胞影响检出率。A.1.3.3肺泡灌洗根据影像学(主要是CT)表现选择BAL（肺泡灌洗）的操作部位。BAL操作前6周内的高分辨率CT影像是较为理想的参考依据。一般使用20ml或60ml的注射器灌注37℃左右(或室温)的0.9%无菌氯化钠溶液(0.9%NaCl)，推荐灌注3～5次，总量一般为100～200ml。支气管镜应嵌紧支气管开口处，以免液体外漏。每次灌注液体后，随即用注射器负压吸引回收，也可直接通过支气管镜吸引至无菌容器中。最佳吸力应由操作者在可视情况下控制，一般以25～100mmHg(1mmHg＝0.133kPa)的负压为宜。一般情况下，肺中叶或舌叶的BALF回收率约为灌入量的40%～70%，肺下叶或其他肺叶至少为30%以上。用于BALF细胞分类计数的回收液一般需达到10～20ml，最少为5ml。A.1.4快速现场评价（ROSE）是指在检查等介入操作过程中由细胞病理学家现场对穿刺小标本进行制片和染色，并进行快速评价、向操作者反馈穿刺是否成功、提供初步诊断的一种方法。当快速现场评价为非诊断材料或恶性细胞比例低，或因临床需要获取更多靶标本行基因检测等情况时，则需要再次穿刺。A.1.4.1ROSE操作流程具体操作流程如下：a)钳夹标本，需以7号注射器针头的针尖将组织标本抵于玻片，以同心圆式涂片；b)毛刷标本需以纵向滚移或同心圆式滚涂于玻片；c)灌洗液标本，需快速离心，弃上清，吸取适量标本滴于玻片，以另一玻片压平后再拉开。涂片忌原地碾压复涂。涂片后立即空气干燥固定或者使用含乙醇的液体固定。涂片后剩余的组织置入病理瓶中待送至病理科行常规病理检查；d)根据现场取材情况，每例患者至少活检2块组织、涂片2张以做ROSE评估，在支气管镜操作现场，采用迪夫染液（Diff-Quickstain）对ROSE细胞学涂片进行快速染色。A.1.4.2ROSE判读巴氏细胞病理学会指南将细胞学评估结果分为5类：C1示没有诊断性价值的标本或标本不适当；C2示良性病变；C3示标本诊断可疑，可能为良性；C4示标本诊断可疑，可能为恶性；C5示恶性病灶。如果标本分类为C2、C5提示标本取样满意、适当，若分类为C3、C4则酌情重新取样以期得到肯定结论。如分类为C1，则必须重新取样。A.1.5样本后续处理A.1.5.1活检钳活检标本放在小片滤纸上，立即浸入盛有10%中性福尔马林溶液的小瓶内固定送检。A.1.5.2支气管刷检刷检后毛刷进行涂片，送细胞学检查的涂片应置于95%酒精中固定送检。A.1.5.3肺泡灌洗应尽量在1h内将BALF送检，新鲜的BALF可直接用于实验室检测；如果转运时间超过30min，应在4℃条件下(置于冰上)转运；若转运时间超过1h，建议先将BALF进行低速离心(250～300g，10min)，保持细胞完整性，然后将细胞沉渣重新悬浮于特定的细胞培养液中(MEM＋25mmol/LHEPES或RPMI1640+25mmol/LHEPES)，4℃保存，24h内进行检测；若无离心条件，可将MEM或RPMI加入灌洗液中，4℃保存，12h内检测。BALF不可冷冻或用干冰转运。A.1.5.4样本固定建议选择中性福尔马林固定液推荐原因如下：T/GRHA0001—2024a)组织固定：中性福尔马林固定液用于固定组织样本，使其保持原始的形态和结构。它能够交联细胞和组织中的蛋白质，防止其在后续处理过程中的降解和变性，从而保持组织的形态和可观察性；b)杀菌作用：中性福尔马林固定液具有较强的杀菌作用，可以杀死细菌、真菌和病毒等微生物，从而避免组织样本在处理过程中的污染和降解；c)保存作用：中性福尔马林固定液可以延缓组织样本的腐败和降解，使其能够在一定时间内得到有效保存。这对于长期保存组织样本以及后续的组织学研究和病理学诊断非常重要；d)防止免疫原性损失：中性福尔马林固定液可以减少组织样本中免疫原的损失，保持其免疫学特性，有利于后续的免疫组织化学和免疫组织染色等实验。A.2FFPE样本准备、保存与运输A.2.1肿瘤组织脱钙含骨或钙化组织的样本需用弱酸（如甲酸）或螯合剂（如EDTA）进行脱钙，避免强酸脱钙处理。A.2.2肿瘤组织固定固定前的操作时间应当越短越好，最优为组织离体0.5小时之内完成，尽量不超过1小时；小块组织宜固定6至12小时，大块组织需切开后固定12至48小时；为避免过度固定，总固定时间不应超过72小时。固定液应选择中性福尔马林缓冲溶液（使用磷酸盐缓冲溶液PBS配制），体积至少应为待固定组织体积的3至5倍。A.2.3肿瘤组织脱水应按照标准作业程序定期更换脱水机内的脱水试剂。A.2.4FFPE样本制作为防止交叉污染，要求使用一次性刀片；每切完一个蜡块后应认真清理设备，不得残留其它病例的组织碎屑；切片数量应满足上机要求(≥10张）；检测前应进行H&E染色评估肿瘤细胞含量，肿瘤含量应达到20%以上，最佳含量为30%以上，肿瘤细胞体积至少达到0.2mm3。A.2.5FFPE样本保存蜡块尽可能无切面常温存储，避免氧气和其它环境因素如光、真菌、昆虫等侵扰，用于高通量测序检测不超过2年为最优；白片可短时间室温或较长时间4℃保存。A.2.6FFPE样本运输应室温或冷藏运输。T/GRHA0001—2024（资料性）申请单模板与送检须知示例B.1申请单模板示例2.根据检测项目不同，可用于辅助临床进行遗传性肿瘤风险分层、诊断、治疗顺利进行，受检者可能需要配合检测机构再次取样（如果因样本运输或其他非检测原因造成的延承诺提供的个人信息真实有效，包括但不限于身份信息、病历病理、诊断报告、检测报*肿瘤类型*临床分期*外周血：____ml，EDTA抗凝____管，BCT无创____管）：B.2送检须知示例B.2.1送检样本必须为10%的中性福尔马林固定的样本，建议于离体后30分钟内被固定（最长不超过1个小时）。B.2.2样本不能出现坏死、钙化及大量结缔组织、脂肪组织等异常情况。B.2.3检测用肿瘤细胞含量应≥20%，建议肿瘤细胞含量≥30%。B.2.4病理医生评估肿瘤含量≥20%的样本，肿瘤细胞体积至少达到0.2mm3。可送检蜡块或或适当数量的白片或蜡卷（置于1.5ml离心管中），同时送检H&E片1张或加送白片1张用于H&E染色后进行肿瘤含量评估。B.2.5当肿瘤细胞＜20%时，不接受蜡卷样本，仅接受蜡块或白片样本，方便实验室对肿瘤细胞进行富集，同时送检H&E片1张或加送白片1张用于H&E染色后进行肿瘤含量评估。B.2.6若为穿刺组织或肿瘤切面较小，需适当增加送检白片或蜡卷数量，保证组织样本抽提获得的DNA量应达50ng以上。T/GRHA0001—2024B.2.7为保证成功率，请尽可能送检一年以内的FFPE样本，不接受H&E染色或免疫组化染色后切片。B.2.8所送检样本需附病理报告复印件。B.2.9随样本应附《检测申请单》，申请单上患者临床信息应完整，必须提供病理诊断结果，样本固定液浓度及固定时间。B.2.10如有特殊要求，应在相应位置注明。T/GRHA0001—2024参考文献[1]非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南（2021版中华病理学杂志，2021，50(4)：323-332.志,2021,101(16):1132-1142.[3]中国临床肿瘤学会（CSCO）小细胞肺癌诊疗指南2022，人民卫生出版社，ISBN978-7-117-32968-2[4]中华医学会肺癌临床诊疗指南（2023版），中华医学杂志，2023，103(27)：2037-2074.[5]NCCNClinicalPracticeGuidelinesinOncology:Non-SmallCellLungCancerVersion1.2024[6]GB/T30989—2014高通量基因测序技术规程[7]GB_T35890-2018高通量测序数据序列格式规范[8]GB/T42216.3-2022/ISO20166-3:2018分子体外诊断检验福尔马林固定及石蜡包埋组织检验前过程的规范[9]GB/T22576.1-2018医学实验室—质量和能力的要求第1部分：通用要求[10]GB19489-2008实验室生物安全通用要求[11]国家卫生健康委肿瘤和血液病相关病种诊疗指南（2022年版）[12]原发性肺癌诊疗指南（2022年版）[13]T/GDPMAA0012—2023高通量基因测序项目分类[14]T/GDPMAA0011-2022医疗机构分子病理实验室建设规范[15]肿瘤突变负荷检测及临床应用中国专家共识（2020年版），中国癌症防治杂志，2020，12(5)：485-494.[16]T/SZGIA4-2018临床单基因遗传病基因检测报告规范[17]CNAS-GL050-2021医学实验室分子诊断领域认可指南[18]中华人民共和国卫生部.医疗机构临床基因扩增检验工作导则（卫办医政发[2010]194号）[EB/OL].2010-12-06.[19]GB/T40664-2021用于高通量测序的核酸类样本质量控制通用要求[20]非小细胞肺癌融合基因检测临床实践中国专家共识（2023版中华病理学杂志，2023，52(6)：565-573.[21]Fusiongenesandchromosometranslocationsinthecommonepithelialcancers.JPathol.2010,220(2):244-54.[22]Comprehensiveassayforthemolecularprofilingofcancerbytargetenrichmentfromformalin-fixedparaffin-embeddedspecimens.CancerSci.2019,110(4):1464-1479.[23]非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南（2021版中华病理学杂志，2021，50(4)：323-332.[24]Theweb-basedmultiplexPCRprimerdesignsoftwareUltiplexandtheassociatedexperimentalworkflow:upto100-plexmultiplicity.BMCGenomics.2021,22(1):835.[25]ValidityofTargetedNext-GenerationSequencinginRoutineCareforIdentifyingClinicallyRelevantMolecularProfilesinNon-Small-CellLungCancer:Resultsofa2-YearExperienceon1343Samples.JMolDiagn.2018,20(4):550-564.[26]Enrichmentofsequencingtargetsfromt