T-GRM 096-2024 矿区生态修复菌剂-深色有隔内生真菌生产技术规范

ICS13.020.01CCSD00/09GRMEcologicalRestorationInoculantsinMiProductionProcessSpecificationsforDarkSeptateEndIT/GRM096—2024前言 2规范性引用文件 3术语和定义 4产品分类 5要求 5.1人员 5.2生产环境 5.3生产设施与设备 5.4产品外观（感官） 25.5产品技术指标 26生产技术 26.1菌种要求 26.2母种培养 26.3液体菌剂摇瓶培养 26.4液体菌剂发酵培养 26.5固体粉剂制备 36.6胶囊菌剂制备 37产品参数检测 37.1外观测定 37.2有效菌落数测定 37.3菌丝干重测定 37.4水分测定 37.5pH值测定 37.6黑色素含量测定 37.7保质期 38检验规则 38.1组批规则 38.2取样方法 38.3检验项目 38.4检查与验收 38.5判定规则 49包装、标识、运输和贮存 49.1包装 49.2标识 49.3运输 49.4贮存 4T/GRM096—2024附录A（规范性）黑色素含量的测定 5A.1方法提要 5A.2试剂和溶液 5A.3仪器 5A.4标准曲线绘制 5A.5测定步骤 5A.6结果计算 5A.7允许误差 5T/GRM096—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。为使我国矿区生态修复菌剂的生产工艺技术走上科学化，规范化轨道，指导矿区微生物复垦工程建设，促进矿区生态环境的恢复与可持续发展，特制定《矿区生态修复菌剂—深色有隔内生真菌》系列标准。本标准主要规定了深色有隔内生真菌菌剂的术语和定义、产品分类、要求、生产技术、产品参数检测、检验规则、包装、标识、运输和贮存。本文件由中关村绿色矿山产业联盟提出并归口。本文件起草单位：中国矿业大学（北京）矿山生态修复研究院、西安科技大学西部矿山生态环境修复研究院、天山实验室、北京合生元生态环境工程技术有限公司。本文件主要起草人：毕银丽、彭苏萍、王淑惠、解琳琳、张延旭、王坤、全文智、肖礼、武超、柯增鸣1T/GRM096—2024矿区生态修复菌剂--深色有隔内生真菌生产技术规范本标准规定了深色有隔内生真菌菌剂的术语和定义、产品分类、要求、生产技术、产品参数检测、检验规则、包装、标识、运输和贮存。本标准适用于矿区生态修复深色有隔内生真菌菌剂产品。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB20287-2006农用微生物菌剂GB19489-2008实验室生物安全通用要求GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T8170-2008数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T603-2023化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1深色有隔内生真菌darkseptateendophytes一类定殖于宿主植物根表皮、皮层，甚至维管束组织细胞内和细胞间隙，形成深色有隔菌丝和微菌核特征结构的内生真菌。3.2生态修复菌剂ecologicalrestorationagent一种以微生物为主要活性成分，其目的是通过微生物的代谢活动和生态功能，改善受损生态系统的生态状况，以促进生态系统的结构和功能恢复，增强生态系统的自我修复能力，维持生态平衡。4产品分类按剂型分为液体、粉剂型和胶囊型。5要求5.1人员工作人员应熟练掌握菌种生产所需的专业技术，并注意保持个人卫生。进入生产场地应穿戴经清洗干净且消毒处理的工作服、口罩、鞋、帽等。5.2生产环境环境空气质量应符合GB3095-2012环境空气质量标准。水电安装合理，通风良好，排气通畅，无菌区与有菌区有效隔离。5.3生产设施与设备生产应具备NY/T528-2010食用菌菌种生产技术规程规定的相关设施设备。应具有天平、高压灭菌锅、净化工作台或接种箱、调温设备、除湿设备、恒温、冰箱、显微镜等常规用具。高压灭菌锅应使2T/GRM096—2024用经有资质部门生产与检验的安全合格产品。压力容器应符合GB/T150-2024压力容器的规定。配料、分装、灭菌、冷却、接种、培养等各环节的设施应配套。冷却室、接种室、培养室和贮存室都要有满足其功能的基本配套设施，如控温设施、消毒设施。5.4产品外观（感官）液体菌剂应菌丝匀质分布，颜色为深褐色或深棕色；固体粉剂产品应松散，灰色粉末状，具有吸水性；胶囊菌剂由食用级药用明胶和淀粉制成的红黄、蓝白、透明等胶囊壳包装固体粉剂。5.5产品技术指标深色有隔内生真菌菌剂产品的技术指标见表1。表1深色有隔内生真菌菌剂产品的技术指标≥ ≤—55≥1666生产技术6.1菌种要求采集矿区本土的深色有隔内生真菌菌种，筛选活性强、植物促生效果好、抗胁迫能力强的菌种。6.2母种培养6.2.1培养基配制PDA培养基：马铃薯浸粉3.0g，葡萄糖20.0g和琼脂粉15.0g混合，加入蒸馏水并定容至1L，加热溶解，分装，pH6.0，121℃高压灭菌15min。6.2.2接种培养在无菌条件下，取直径5mm的菌饼于PDA固体培养基，28℃黑暗倒置培养12-16天，确保菌饼长满整个培养皿。6.3液体菌剂摇瓶培养6.3.1培养基配制MMN培养基：氯化钙0.05g、硫酸镁0.15g、氯化钠0.025g、氯化铁0.01g、磷酸二氢钾0.5g、维生素B10.0001g、磷酸氢二铵0.25g、葡萄糖10g、柠檬酸0.2g和麦芽提取物10g混合，得到混合物，加入蒸馏水并定容至1L，分装，pH5.5，121℃高压灭菌30min。6.3.2接种培养在无菌条件下，取直径5mm的菌饼接种于装有200mLMMN培养基的500mL锥形瓶中，28℃,180rpm振荡培养6-10天，使该菌株生长至对数生长期。6.4液体菌剂发酵培养6.4.1培养基配制蔗糖30g、麦芽提取物25g、磷酸氢二钾2g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.45g和维生素B10.02g，加入蒸馏水并定容至1L，pH7.0，121℃高压灭菌20min。3T/GRM096—20246.4.2接种培养将培养好的母种接种于装有7L发酵培养基的10L发酵罐中，接种量为10%，初始搅拌转速为400rpm，6h-120h搅拌转速设置为300rpm，罐体压力为0.05MPa，共培养4-6天，可采用分批发酵、流加发酵或连续发酵工艺，具体选择视规模和生产需求而定。6.5固体粉剂制备将菌液分装至10mL无菌离心管，10000rpm，4℃,离心5min，收集DSE菌丝。菌丝用无菌水清洗5-6遍。将洗净的菌丝置于烘箱中60℃干燥2-3天，直至恒重后，研磨，过1mm筛。6.6胶囊菌剂制备将固体粉剂使用胶囊机制成菌剂胶囊，胶囊遇水可以降解，缓释出固体菌剂，每个胶囊菌剂含量约0.2g，密封防潮吸水。7产品参数检测7.1外观测定取少量样品放到白色塑料盘中，仔细观察样品的颜色、形状、质地。7.2有效菌落数测定采用平板计数法，参照GB20287-20066.3.2的规定执行。7.3菌丝干重测定将洗净的菌丝置于烘箱中60℃干燥2-3天，直至恒重后，称菌丝体质量。7.4水分测定参照GB20287-20066.3.5的规定执行。7.5pH值测定参照GB20287-20066.3.7的规定执行。7.6黑色素含量测定深色有隔内生真菌菌丝黑色素含量测定方法参照附录A执行。7.7保质期在产品说明书标明的保质期前，测定产品相应指标。8检验规则8.1组批规则深色有隔内生真菌菌剂应批次提交验收，每批应保证同等质量的产品组成。8.2取样方法将样品应被分为两份，每个试样不少于完整规格测试所需数量的两倍，分别入带有干燥剂的离心管中，贴上标签，注明试样名称、生产日期。供检验和查用。8.3检验项目本文件5.4和5.5中规定的所有项目均为出厂检验项目。8.4检查与验收4T/GRM096—2024产品需经供方检测，确保其符合本标准要求。需方收到产品后，应根据本标准规定进行检验。如检测结果与标准或合同（订货单）不符，需在收到产品后15日内向供方提出，由双方协商解决。8.5判定规则具下列任何一条款者，均为合格产品：a）检验结果各项技术指标均符合标准要求的产品；b）在产品的外观、菌丝干重、水分、pH值、黑色素含量等检测项目中，有一项不符合要求，而其他各项技术指标符合要求的产品。具下列任何一条款者，均为不合格产品：a）有效活菌数不符合技术指标；b）杂菌率不符合技术指标；c）在外观、菌丝干重、水分、pH值、黑色素含量等检测项目中，有两项（含）以上不符合要求。本文件中产品质量指标合格判定，采用GB/T8170-2008中修约值比较法的规定。9包装、标识、运输和贮存9.1包装根据不同产品剂型选择适当的包装材料、容器、形式和方法，以满足菌剂产品包装的基本要求。产品包装中应有产品使用说明书，在使用说明书中标明使用范围、方法，用量及注意事项等内容。液态菌剂可使用无菌塑料瓶灌装；粉剂产品可使用无菌塑料管包装，或者根据用量独立包装成胶囊，装在瓶内，内置干燥剂防潮。9.2标识产品外包装需明确标注生产日期、批次、成分含量、储存条件及适用领域。9.3运输运输过程中有遮盖物，防止雨淋、日晒及高温。保证产品轻装轻卸，避免包装破损。严禁与对微生物菌剂有毒、有害的其他物品混装、混运。9.4贮存液态菌剂应冷藏贮存（2-8℃)。粉剂、胶囊型产品应贮存在阴凉、干燥、通风的库房内，应避免高温、高湿等不良条件的影响。5T/GRM096—2024（规范性）黑色素含量的测定A.1方法提要黑色素是一种复杂的酚类或吲哚类生物色素，主要由苯环、吡咯糖环、吡咯醌结构等组成。这种特殊的分子结构使得黑色素具有在强碱溶液中溶解，在强酸条件下沉淀的性质。A.2试剂和溶液a)无菌水(或生理盐水)、蒸馏水。b)氢氧化钠溶液（0.1mol/L）：称取4.0g氢氧化钠，用蒸馏水定容1L。c)氢氧化钠溶液（6mol/L）：称取240.0g氢氧化钠，用蒸馏水定容1L。d)盐酸溶液（8mol/L假定用36.5%的浓盐酸（密度1.19g/mL量筒量取浓盐酸672.3mL，在烧杯中稀释浓盐酸，恢复至室温，用蒸馏水定容1L。e)氯仿。f)乙酸乙酯。g)黑色素标准溶液（CAS：8049-97-6）：10mg黑色素溶解于100mL0.1mol/L氢氧化钠溶液中，得到100μg/mL黑色素标准溶液。A.3仪器a)烘箱。b)粉碎机。c)电子天平。d)超声波清洗仪。e)紫外分光光度计。A.4标准曲线绘制表A.1不同浓度标准黑色素溶液的制备100234560A.5测定步骤将干燥菌丝磨成细粉，称取1.0g菌丝用30mL蒸馏水清洗5min，4000rpm离心5min。丢弃上清液，将颗粒