2.2.2 动物细胞融合技术与单克隆抗体课件【知识精研】高二下学期生物人教版选择性必修3

第2章

细胞工程动物细胞融合技术与单克隆抗体

植物体细胞杂交技术打破生殖隔离,实现远缘杂交育种，培育植物新品种。

有没有技术让不同种动物的体细胞杂交，培育出集中不同细胞优势于一身的动物细胞呢？实例：1970年，人-鼠细胞荧光标记融合实验——动物细胞融合技术一、动物细胞融合技术

动物细胞进行融合，与植物细胞融合有哪些不同之处？动物细胞没有细胞壁阻碍细胞融合，没有去除细胞壁的操作。一、动物细胞融合技术1.概念：两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。2.原理：细胞膜具有一定的流动性。得到的细胞叫杂交细胞，是单核细胞。3.诱导融合的方法：PEG融合法（化学法）、电融合法（物理法）、灭活病毒诱导法等动物细胞融合特有的方法。灭活是指用物理或化学方法使病毒失去感染能力，但是并不破坏这些病原体的抗原结构。诱导融合的机理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。一、动物细胞融合技术用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程：灭活的病毒颗粒粘附于细胞表面使细胞互相凝聚细胞膜融合细胞膜打开细胞质融合细胞核融合形成杂交细胞实例：19世纪30年代，科学家曾在肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的

病理组织中观察到多核细胞。一、动物细胞融合技术4.意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。5.应用：研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。特别是杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。

如右图所示，采用PEG融合法、电融合法或灭活的病毒诱导A、B两类动物细胞融合？思考：1.A细胞和B细胞一定要来自同一个物种吗？2.最多考虑细胞两两融合的情况下，经过促融后的培养液中存在多少种细胞？不用是同一物种。5种，A-A、B-B、A-B（杂交细胞）、A、B植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志意义主要用途细胞膜具有一定的流动性植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性用果胶酶和纤维素酶去壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞电融合法、高Ca2+-高pH融合法；离心法、聚乙二醇（PEG）融合法聚乙二醇（PEG）融合法、电融合法、灭活病毒诱导法再生出细胞壁细胞核的融合打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较传统的抗体的获得方法：一个抗原通常含有多种不同的抗原决定簇注射抗原一个B淋巴细胞只能产生一种抗体，该抗体识别并结合一种抗原决定簇产量低；纯度低；特异性差。多种抗体向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。产生多种抗体的B细胞怎样才能获得大量单一的某种抗体？大量制备单一抗体的思路：单一B淋巴细胞每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体

选择克隆单一B淋巴细胞的子细胞群大量纯度高、特异性强的抗体产生在体外培养条件下，一个B淋巴细胞不可能无限增殖的。怎样才能使B细胞在产生抗体的同时，具备无限增殖能力呢？一个极富创造力的方案：骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体动物细胞融合杂交细胞杂交瘤细胞动物细胞培养单克隆抗体二、单克隆抗体及其应用注射特定的抗原1.过程：用特定抗原对小鼠免疫，并从其脾中获取能产生特定抗体的B淋巴细胞多种B淋巴细胞培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合诱导融合用特定的选择培养基进行筛选：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。杂交瘤细胞（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（分泌的抗体能与特定抗原结合）将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖体外培养注射到小鼠腹腔内单克隆抗体从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体

已免疫的B淋巴细胞多种杂交细胞二、单克隆抗体及其应用分析单克隆抗体的制备过程：（1）B淋巴细胞与骨髓瘤细胞经诱导融合后（若融合的话，只考虑两两融合），培养基中共出现几类细胞？其中融合的细胞有几类？多种B淋巴细胞骨髓瘤细胞将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合诱导融合多种杂交细胞杂交瘤细胞筛选（2）诱导细胞融合后的筛选目的是什么？怎么筛选？筛选出的细胞有什么特点？共有5类细胞。其中融合的细胞有3类。目的是筛选出杂交瘤细胞。方法是用选择培养基进行筛选。既能迅速大量增殖，又能产生抗体。【拓展】

单克隆抗体培养过程中选择培养基筛选杂交瘤细胞的原理B淋巴细胞（B）骨髓瘤细胞（A）D途径S途径合成DNAD途径××细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基蝶呤阻断。免疫的B淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但它不能分裂增殖，其本身也不能在体外长期存活。鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但它能不断分裂增殖。如果它的D途径被阻断的话，它会因不能合成DNA而死亡。请根据上述资料提出筛选出杂交瘤细胞的方法？A、B、A-A、B-B、A-B培养基中加入氨基蝶呤。二、单克隆抗体及其应用分析单克隆抗体的制备过程：杂交瘤细胞（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（分泌的抗体能与特定抗原结合）对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞（3）筛选出杂交瘤细胞之后的筛选目的是什么？方法是什么？其原理是什么？目的是筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。方法是抗体检测（抗原-抗体杂交）。其原理是抗原-抗体的特异性结合。由于初次筛选出的杂交瘤细胞有多种，且融合细胞中染色体可能会随机丢失，导致部分杂交瘤细胞在培养时会失去增殖或分泌抗体的能力，因此后续需要经过多次筛选出能产生专一抗体的杂交瘤细胞。【拓展】

杂交瘤细胞的抗体检测和克隆化培养将杂交瘤细胞进行有限稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。多孔细胞培养板然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。二、单克隆抗体及其应用分析单克隆抗体的制备过程：（4）培养杂交瘤细胞的方法有哪些？从哪里收集产物？方法的优缺点？抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞体外培养注射到腹腔单克隆抗体注入动物腹腔内培养和在体外培养液中培养。动物腹水中收集、在培养液中收集。腹腔中培养易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低，缺点是规模小，产量少；体外培养可大规模培养，大量生产，缺点是需要人为控制培养条件，成本相对较高。【拓展】

抗体的人源化

利用小鼠获得的单克隆抗体，能直接用于人体吗？为什么？不能，单克隆抗体会被人体当做抗原，发生免疫反应。单克隆抗体的应用资料1：用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”，在妊娠第8天就可以做出诊断，这比原来的诊断提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。单克隆抗体的应用资料2：使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体—药物偶联物（antibody-drugconjugate，ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。ADC的作用机制示意图单克隆抗体的应用讨论：1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？

抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞。

药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。单克隆抗体的应用讨论：2.除了细胞毒素外，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？

可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；

一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。单克隆抗体的应用讨论：3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？

单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原发生反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。二、单克隆抗体及其应用2.优点：（2）

能准确地识别抗原的细微差异。（1）

与特定抗原发生特异性结合。（3）

可以大量制备。特异性强灵敏度高可大量制备3.应用：（1）广泛用作诊断试剂

利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。（2）运载药物

“生物导弹”--靶向运输药物治疗疾病（3）直接用于治疗疾病请用箭头把以下部分步骤的字母按正确顺序连接起来。BAECGDHF甲状旁腺激素（PTH）水平是人类多种疾病的重要诊断指标。研究者制备单克隆抗体用于快速检测PTH，有关制备过程的叙述不正确的是（）A．需要使用动物细胞培养技术B．需要制备用PTH免疫的小鼠C．利用抗原-抗体结合的原理筛选杂交瘤细胞D．筛选能分泌多种抗体的单个杂交瘤细胞D

利用细胞融合技术可以制备单克隆抗体，下列关于该过程的叙述正确的是（）A．杂交瘤细胞能无限增殖，无需进行传代培养B．利用抗原抗体反应即可筛选出杂交瘤细胞C．外界抗原多次刺激动物可以提高动物体内杂交瘤细胞的数量D．体外培养杂交瘤细胞需提供CO₂以维持培养液的pHD

如图所示，将由2种不同的抗原分别制备的单克隆抗体分子，在体外解偶联后重新偶联可制备双特异性抗体，简称双抗。下列说法错误的是（

）A．双抗可同时与2种抗原结合B．利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞C．筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原D．同时注射2种抗原可刺激B细胞分化为产双抗的浆细胞D

新型冠状病毒表面的刺突蛋白(S蛋白)与人呼吸道黏膜上皮细胞ACE2受体结合，入侵细胞后可引起肺炎。针对此环节研发单克隆抗体是治疗新冠肺炎的研究热点之一，下列相关叙述错误的是()A.①过程需多次向小鼠体内注射S蛋白，以便于从脾脏中获得致敏的B淋巴细胞B.②过程可通过电融合法使两个细胞融合C.经③过程筛出的细胞既能无限增殖又能产生识别S蛋白的单克隆抗体D.S蛋白的单克隆抗体能够阻断病毒入侵正常细胞以减弱对机体的毒害C

抗体—药物偶联物(ADC)通过将细胞毒素与单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤，过程如图所示。下列叙述不正确的是()A.抗体进入细胞后激活溶酶体酶，导致细胞凋亡B.ADC可通过胞吞方式进入肿瘤细胞C.单克隆抗体携带细胞毒素与肿瘤细胞特异性结合D.肿瘤细胞凋亡是细胞主动死亡的过程，会产生新的蛋白质A

乳腺癌化疗的药物在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，为降低药物对患者的副作用，科研人员尝试在单克隆抗体技术的基础上，构建抗体一药物偶联物（ADC），过程如图所示。下列相关说法正确的是(

)A.对①过程形成的杂交细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可以获得能分泌所需抗体的细胞B.ADC通常由抗体、接头和药物三部分组成，ADC起作用时会被细胞吞噬，并在溶酶体内被分解后释放药物C.经步骤③筛选得到的杂交瘤细胞具有的特点是能准确识别抗原的细微差异并能大量制备D.