3.1重组DNA技术的基本工具课件【知识精研】高二下学期生物人教版选择性必修3

怎样培养出具有抗虫性状的抗虫棉呢？

我国是棉花的生产和消费大国，棉花在种植过程中常常会受到棉铃虫的侵袭，这会使棉花大量减产。大量施用农药不仅提高了生产成本，还可能造成农产品和环境的污染，如果能培育出自身能抵抗棉铃虫的棉花就能解决这个问题。

棉花本身不具有“杀虫基因”，而苏云金杆菌有一种“杀虫基因”，它能通过编码产生抗虫蛋白来杀死棉铃虫。一、基因工程的诞生和发展阅读教材证明DNA是遗传物质建立DNA双螺旋结构模型，提出自我复制假说发现DNA、质粒可以在细菌细胞间转移发现限制酶、DNA连接酶、逆转录酶证明可以用质粒构建重组DNA，外源基因可以在原核细胞中成功表达，实现种间基因交流首次体外构建重组DNA分子1944艾弗里1953沃森、克里克证明DNA自我复制1958梅塞尔森、斯塔尔提出中心法则1958克里克1944艾弗里·1967基因可以控制性状1970可以拼接产生新基因1972伯格1973性状转移基因工程基因组编辑技术2013主线Ⅰ一、基因工程的诞生和发展阅读教材首次完成胰岛素氨基酸测序发明DNA序列分析方法，DNA合成仪问世发明PCR技术发明高通量测序技术主线Ⅱ基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。基因工程：是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫

重组DNA技术1.操作环境：2.原理：3.操作对象：4.操作水平：5.结果：体外环境基因分子水平基因重组赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍6.意义：二、基因工程【典例1】人的胰岛素基因能通过拼接并在受体细胞大肠杆菌中表达出相同蛋白质--胰岛素的理论基础是？（1）大肠杆菌和人的遗传物质都是

。（2）不同生物的DNA分子能够拼接在一起，原因是：

。

（3）同一种基因在不同生物体内表达出来的蛋白质相同，因为：

。（4）遗传信息的传递都遵循

。(5)

为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？

。

DNA中心法则基本组成单位、空间结构（规则的双螺旋结构）和碱基互补配对方式相同所有生物共用一整套遗传密码①基因是控制生物性状的结构和功能单位②遗传信息的传递都遵循中心法则③生物界共同一套遗传密码二、基因工程理论基础：基因拼接：①基本组成单位都是四种脱氧核苷酸②都遵循碱基互补配对原则③都是规则的双螺旋结构外源基因表达：①基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能单位②遗传信息的传递都遵循中心法则③生物界共用一套遗传密码二、基因工程第3章第1节

重组DNA技术的基本工具资料1：棉花本身不具有“杀虫基因”，而苏云金杆菌有一种“杀虫基因”，它能通过编码产生抗虫蛋白来杀死棉铃虫。资料2：番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。“分子运输车”“分子手术刀”“分子缝合针”“工欲善其事必先利其器”目录Contents1限制性核酸内切酶--“分子手术刀”2DNA连接酶--“分子缝合针”3基因进入受体细胞的载体--“分子运输车”01限制性核酸内切酶--“分子手术刀”一、限制性核酸内切酶--“分子手术刀”主要是原核生物来源1、识别双链DNA分子的特定核苷酸序列作用特点2、断开特定部位的磷酸二酯键5'3'5'3'TAGGTATCCA①②【例】断开

。①资料11970年，史密斯（H.D.Smith)等人首次从大肠杆菌中提取出了一种限制性内切核酸酶（restrictionendonuclease)。这种内切核酸酶能够识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特异性的位点上把双链DNA分子“切割”开（如图)。DNA被切割后所产生的交错的切口，也就是在每条链的一端留下的单链末端，叫做黏性末端。一、限制性核酸内切酶--“分子手术刀”AGTCATTCGATAGGATCATCATAT

大肠杆菌(E.coli)的EcoRⅠ限制酶能特异性识别_________序列，并切割___和___之间的____________。切割后产生__________。GAATTCGA磷酸二酯键黏性末端EcoRI一、限制性核酸内切酶--“分子手术刀”SmaI限制酶只能识别

序列，切割

和

之间的

切开，切割后产生

。CCCGGGCG磷酸二酯键平末端SmaICCCGGGGGGCCCGGGCCCCCCGGGEcoRⅠ5’…G-A-A-T-T-C…3’3’…C-T-T-A-A-G…5’SmaⅠ5’…C-C-C-G-G-G…3’3’…G-G-G-C-C-C…5’BamHⅠ5’…G-G-A-T-C-C…3’3’…C-C-T-A-G-G…5’TaqⅠ5’……T-C-G-A……3’3’……A-G-C-T……5’1.一个限制酶切割一次断

个磷酸二酯键形成___个黏性末端2.同一种限制酶切割形成的黏性末端____两相同一、限制性核酸内切酶--“分子手术刀”回文序列形成黏性末端或平末端结果两1.你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？2.为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？一、限制性核酸内切酶--“分子手术刀”原核生物容易受到外源DNA的入侵限制酶的作用：切割外源DNA,使之失效保证自身的安全DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者DNA分子被修饰（甲基化），使限制酶不能将其切开—CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA——GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT——CTACGATG—GATGCTACTTAAAATTCCCTAA—GGGATT—黏性末端【典例1】使用EcoRI剪切目的基因，写出切割后的序列一、限制性核酸内切酶--“分子手术刀”【典例2】要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几次？可产生几个黏性(平)末端？要切两次，产生四个黏性(平)末端。目的基因AATTCCGTAGGGCATCTTAAG

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GG

C

TT

AA

AA

TT

C

GGC

TT

AA

AA

TT

C

G用同种限制酶切割(EcoRⅠ)【典例3】把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？一、限制性核酸内切酶--“分子手术刀”

缺口怎么办？G

C

TT

AA

AA

TT

C

GGCTTAA

AA

TT

C

G一、限制性核酸内切酶--“分子手术刀”【典例3】把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？02DNA连接酶--“分子缝合针”资料21967年，科学家们发现了一种能够将两个DNA片段连接起来的酶，可以用它来修复DNA链的断裂口，并把这种酶叫做DNA连接酶。1970年，科学家们又提取了一种具有更高活性的T4DNA连接酶。当两个DNA片段的黏性末端彼此相临，而且它们的碱基能够互补配对时，DNA连接酶就能把它们之间的缝隙“缝合”起来（如图）。二、DNA连接酶--“分子缝合针”

将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的

，形成重组DNA分子。作用分类种类E·coli

DNA连接酶T4DNA连接酶来源作用相同点大肠杆菌T4噬菌体只连接黏性末端既可以连接黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端（效率较低）恢复的都是磷酸二酯键二、DNA连接酶--“分子缝合针”磷酸二酯键AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶二、DNA连接酶--“分子缝合针”比较DNA连接酶和DNA聚合酶

AA

TT

C

GGCTTAADNA连接酶DNA连接酶DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象

作用结果 用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质

不需要需要形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上两个DNA片段二、DNA连接酶--“分子缝合针”比较DNA连接酶和DNA聚合酶【典例4】根据所学知识，完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA连接酶④DNA聚合酶baA.切断a处的酶为_______

B.连接a处的酶为_______C.切断b处的酶为_______①③④②二、DNA连接酶--“分子缝合针”03基因进入受体细胞的载体--“分子运输车”资料41973年，美国科学家科恩（S.Cohen)等人从大肠杆菌中提取出了两种质粒，一种含有卡那霉素抗性基因，另一种含有四环素抗性基因。他们将这两种基因分别“切割”下来，并拼接在同一个质粒上，然后导入大肠杆菌，产生了既抗卡那霉素又抗四环素的大肠杆菌。三、基因进入受体细胞的载体--“分子运输车”作用种类三、基因进入受体细胞的载体--“分子运输车”作为载体需具备的条件将外源基因送入受体细胞。质粒（最常用）动植物病毒噬菌体①能够在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。②具一个或多个限制酶切点，供外源DNA插入其中。③具有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细胞核或拟核DNA之外，并具有自我复制能力的

（化学本质），故质粒有

个游离的磷酸基团②质粒上的氨苄青霉素抗性基因为

，还有如：

等；其作用是：

。双链环状DNA分子0标记基因用于鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞四环素抗性基因三、基因进入受体细胞的载体--“分子运输车”③在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。存在于许多细菌及酵母菌等生物中利用标记基因进行筛选示例：重组DNA导入受体细胞不是100%，而且导入率较低标记基因的筛选原理：载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。噬菌体或某些动植物病毒作为运载体利用的原理是：病毒对宿主细胞的侵染具有一定的

性。利用病毒对宿主细胞的侵染性特异若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用

作为载体，其原因是：噬菌体噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕三、基因进入受体细胞的载体--“分子运输车”噬菌体、动植物病毒【典例5】（1）质粒与拟核中的DNA有哪些相同点：（至少写出两点）

①

。

②

。

③

。（2）质粒

（是/不是）一种细胞器。（3）细胞膜上的载体蛋白与基因工程中的载体的区别

①化学本质不同：细胞膜上的载体：

。基因工程中的载体可能是物质，如

；也可是生物，如

或噬菌体。

②功能不同：细胞膜上的载体功能是

;基因工程中的载体是一种“分子运输车”,把

。化学本质和结构相同能够自我复制具有遗传效应或都能够指导蛋白质的合成等不是蛋白质质粒动植物病毒控制物质进出细胞目的基因导入受体细胞重组DNA分子请在两张纸上分别写上下面两段DNA序列：

请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。然后,用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后,将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处,并用透明胶条将切口粘连起来。1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”?剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。重组DNA分子请在两张纸上分别写上下面两段DNA序列：

请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。然后,用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后,将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处,并用透明胶条将切口粘连起来。

2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？你能用DNA连接酶将他们连接起来吗？1和

；2和

；4和

。3、6、758限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开么？以下四种不同限制酶切割形成的DNA片段：2

已知BamHⅠ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，Sau3AⅠ的识别序列和切点是—↓GATC—BamHⅠSau3AⅠ不同限制酶切割形成的黏性末端可能相同。且连接后不能再被原来的限制酶识别。

多否【典例7】下列有关如图所示的黏性末端的说法，错误的是(

)【典例6】质粒是基因工程中最常用的运载体，它的主要特点是（）①能自主复制②不能自主复制③结构很小④蛋白质⑤环状RNA⑥环状DNA⑦能“友好”地“借居”A．①③⑤⑦ B．①④⑥C．①③⑥⑦ D．②③⑥⑦CCA.甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的B.甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲、丙不能C.DNA连接酶的作用位点是b处D.切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末端形成的重组DNA分子片段【典例8】如表为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，据表分析以下说法正确的是(

)限制酶BamHⅠEcoRⅠHindⅡ识别序列和切割位点G↓GATCCG↓AATTCGTY↓RAC限制酶KpnⅠSau3AⅠSmaⅠ识别序列和切割位点GGTAC↓C↓GATCCCC↓GGG(注：Y表示C或T，R表示A或G)DA.一种限制酶只能识别一种脱氧核苷酸序列B.限制酶的切割位点一定位于识别序列的内部C.不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端D.限制酶切割后形成的不一定都是黏性末端【典例9】图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。（1）上述操作中不宜选用SmaI，原因是SmaI会破坏__________和_____________。（2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，__________________________________________________。目的基因抗性基因目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中(1)在培养细菌的培养基中添加抗生素B，则应该选择的限制酶为_______。(2)在培养细菌的培养基中添加抗生素A，则应该选择的限制酶为_____。①或②①选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来。【典例10】用限制酶EcoRⅤ单独切割某质粒，可产生1个14kb(1kb即1000个碱基对)的长链，而同时用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ联合切割该质粒，可得到三种长度的DNA片段，见下图(其中*表示EcoRⅤ切割后的一个黏性末端)。若用MboⅠ单独切割该质粒，则产生的DNA片段的长度为(

)A.2.5kb和5.5kb B.2.5kb和6kbC.5.5kb和8kb D.6kb和8kbD一个酶切位点两个酶切位点【典例11】在DNA测序工作中，需要将某些限制酶的限制位点在DNA上定位，使其成为DNA分子中的物理参照点。这项工作叫做“限制酶图谱的构建”。假设有以下一项实验：用限制酶HindⅢ，BamHⅠ和二者的混合物分别降解一个4kb（1kb即1千个碱基对）大小的线性DNA分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，如下图所示。据此分析，这两种限制性内切酶在该DNA分子上的限制位点数目分别是：尝试在该DNA片段上画出两种限制酶识别位点：1个2个HindⅢBamHⅠBamHⅠ0.3kb0.9kb1.0kb1.8kb【典例12】限制酶能识别特定的DNA序列并进行剪切。现以3种不同的限制性酶对一6.2kb大小的线状DNA进行剪切后。用凝胶电泳分离各核酸片段，实验结果如图所示。请画出3种不同的限制酶在此DNA片段上相应切点的位置1个2个2个A0.30.7BCABA2.6A0.50.9C1.21.提取DNA的方法

利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。（1）提取生物大分子的基本思路

选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子（2）提取DNA的基本思路（DNA的粗提取）【实验：DNA的粗提取与鉴定】【实验：DNA的粗提取与鉴定】2.实验原理提取原理：（1）DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精（2）在2mol/L的NaCl溶液中溶解度最高鉴定原理：（3）一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色0DNA溶解度NaCl浓度0.14mol/L2mol/LDNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。

不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为：哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。3.选材：注意：试剂：①研磨液②体积分数为95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺试剂⑤蒸馏水——含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl——析出DNA——溶解DNA——鉴定DNA，要现配现用【实验：DNA的粗提取与鉴定】【实验：DNA的粗提取与鉴定】4.实验步骤(1)称取约30g洋葱,切碎,然后放入研中,倒入10mL研磨液,充分研磨。(2)在漏斗中垫上纱布,将洋葱研磨液过滤到烧杯中,在4℃冰箱中放置几分钟后,再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中,在1500r/min的转速下离心5min,再取上清液放入烧杯中。研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而影响提取的DNA含量过滤能用滤纸代替吗？不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。4.实验步骤(3)在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%),静置2~3min,溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸去上面的水分;或者将溶液倒入塑料离心管中,在10000r/min的转速下离心5min,弃上清液,将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。（1）冷却的酒精溶液(体积分数95％)作用：一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。避免破坏DNA【实验：DNA的粗提取与鉴定】这一步的目的是蛋白质溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。(4)取两支20mL的试管,各加入2mol/L的NaC1溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaC1溶液中。然后,向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后,将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后,比较两支试管中溶液颜色的变化。4.实验步骤【实验：DNA的粗提取与鉴定】实验组对照组水浴加热【请同学们补充完整以下实验步骤】试管编号A（对照组）B（实验组）步骤12mol/L的NaC1溶液5mL步骤2不进行任何处理步骤3步骤4沸水浴加热5min实验现象溶液不变蓝色实验结论加丝状物或沉淀物加4mL的二苯胺试剂溶液逐渐变蓝DNA在沸水浴下遇二苯胺试剂，冷却后会呈现蓝色一、CA二、练习与应用1.因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转