液质联用法测定婴幼儿奶粉中左旋肉碱含量不确定度评定

左旋肉碱又称L－肉碱，是一种促进人体脂肪转换为动能的类碳水化合物，不仅可用于减肥类的保健食品，也可用于婴幼儿食品。奶粉中的左旋肉碱是促进奶粉中的脂肪分解、代谢、供能的重要营养素，可以促进体内脂肪的代谢和利用。婴幼儿饮食结构比较单一，其主要饮食来源为各种乳制品，主要能量来源为乳制品中的脂肪。添加左旋肉碱，可以提高婴幼儿对奶粉中脂肪的利用率[1]。因此，本文依据SN/T5146—2019第二法[2]液相色谱-质谱法测定婴幼儿奶粉中左旋肉碱的含量。同时，分析婴幼儿奶粉中的左旋肉碱含量不确定度，以供参考[3]。1材料与方法1.1试剂乙腈（色谱纯，Merck）；甲醇（色谱纯，Merck）；氨水（AR，湖南汇虹）；盐酸（GR，国药集团）；甲酸（HPLC，科密欧），左旋肉碱（坛墨，批号2362012；含量99.90%；U=0.5%）；D3-左旋肉碱（TRC，批号：5-BKS-60-2）。1.2标准溶液配制1.2.1标准储备液称取左旋肉碱标准品7.30mg，乙腈溶解，配制成浓度为729.27μg·mL-1的标准储备溶液，4℃以下避光保存。1.2.2标准中间液准确吸取标准储备液（729.27μg·mL-1）0.10mL，用乙腈稀释至10mL，摇匀，制成7.2927μg·mL-1的标准中间液，4℃以下避光保存。1.2.3D3-左旋肉碱内标标准储备液准确称取标准品5.00mg，用乙腈溶解，配制成浓度为500μg·mL-1的标准储备液，4℃以下避光保存。1.2.4D3-左旋肉碱内标标准中间液准确吸取D3-左旋肉碱内标标准储备液（500μg·mL-1）0.20mL，用乙腈稀释至10mL，摇匀，制成10μg·mL-1的标准中间液，4℃以下避光保存。1.2.5标准工作液准确移取标准中间液和内标标准中间液适量，用0.1%甲酸水溶液溶解并稀释，配制成内标浓度为100ng·mL-1，以及左旋肉碱浓度分别为0.3646、1.8232、18.2312、72.927、145.854、364.635ng·mL-1的系列标准溶液，现用现配。1.3仪器与设备AB-3500液质联用仪（美国AB）；十万分之一电子天平（XS205，梅特勒）；万分之一电子天平（AR224CN，奥豪斯）；ASE-12固相萃取装置；TG18G-Ⅱ离心机；WD-12氮吹仪；SHA-C(A）恒温水浴振荡器；SPE固相萃取柱（OasisMCX柱，60mg/3mL，Waters）。1.4测定方法1.4.1样品提取与净化称取试样1g→50mL离心管→加内标标准中间液100μL→加入20mL的0.1mol·L-1盐酸溶液→摇匀，超声5min→加入5mL的1mol·L-1氢氧化钾溶液，混匀→60℃水浴皂化30min→冷却至室温→加5mL的1mol·L-1盐酸溶液→涡旋1min→移至50mL容量瓶→用0.1mol·L-1盐酸溶液润洗离心管，合并润洗液至容量瓶→用0.1mol·L-1盐酸溶液定容至刻度→取1.00mL提取液于15mL离心管→加入9.0mL乙腈→涡旋混匀1min→离心→取1.00mL上清液过OasisMCX固相萃取小柱（依次使用3mL甲醇、3mL水和3mL10mmol·L-1盐酸活化）→用3mL的10mmol·L-1盐酸溶液淋洗→弃去淋洗液→抽干小柱→加2mL4%氨水甲醇溶液洗脱→收集洗脱液→40℃氮吹干→加入1.0mL0.1%甲酸水溶液溶解残渣→过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。1.4.2标准曲线建立以左旋肉碱和D3-左旋肉碱浓度比为横坐标，左旋肉碱和D3-左旋肉碱内标峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线。1.5建立数学模型式中，X为样品中左旋肉碱的含量，mg·kg-1；V为样品定容体积，mL；n为样品稀释倍数；m为试样质量，g；1000为换算系数。1.6不确定度来源的识别对过程分析可知，左旋肉碱含量测定的不确定度主要有以下4个方面[4]：样品称量过程引入的标准不确定度urel（m）；样品测试液中左旋肉碱浓度引入的不确定度urel（C）；样品稀释体积引入的不确定度urel（V）；重复性引入的不确定度urel（r）。2不确定度分量的评定与合成2.1A类不确定度重复性引入的不确定度urel（r），主要受操作过程、样品特性和仪器本身性能等因素的影响，独立测定6次，结果如下：35.88、36.27、36.59、35.57、36.59、36.50mg·kg-1。6次测量标准偏差：实际检测时，进行平行实验，标准不确定度：重复性引入的相对标准不确定度：2.2B类不确定度2.2.1样品称量过程引入的标准不确定度urel（m）样品平均质量为1.0344g，称量范围内的最大允许误差为±0.5mg，按均匀分布考虑（k=），则称量引入的标准不确定度：其相对标准不确定度：2.2.2样品测试液中左旋肉碱浓度引入的不确定度urel（c）（1）标准曲线拟合的相对不确定度分量urel（C1）。对6个标准系列溶液各进样1次，共计6次，得到左旋肉碱峰面积A1和D3-左旋肉碱A2，结果见表1。表1左旋肉碱标准曲线方程数据表以左旋肉碱和内标浓度之比为横坐标，左旋肉碱峰面积和内标峰面积之比为纵坐标，绘制标准曲线。标准工作曲线为：Y=2.15416X+0.00759，相关系数R=0.9999。标液中左旋肉碱和内标浓度之比的平均值：峰面积比值的残差标准偏差：对被测样品的提取液共测量1次，即p=1，测得提取液中左旋肉碱浓度和D3-左旋肉碱浓度比值X=0.72868。于是其标准不确定度u（c1）：（2）储备液与标准系列溶液的配制引入的不确定度urel（c2）。标准溶液配制时的不确定度主要来源为标准品的称量、标准品纯度和定容。①标准物质纯度引入的不确定度urel（c21）本次使用的左旋肉碱标准品的证书标识纯度为99.90%；urel=0.5%，则urel（c21）=0.005；D3-左旋肉碱带入的不确定度不予考虑。②标准品称量引入的不确定度urel（c22）本次左旋肉碱标准品配制时采用的是十万分之一电子天平，其质量为7.30mg，该天平准确度等级为Ⅰ级，在（0g≤m≤50g）称量范围内的最大允许误差为±0.05mg，可按均匀分布考虑（k=），则标准品称量引入的相对标准不确定度：③标准溶液配制过程量器具及温度变化引入的不确定度urel（c23）标准储备液、中间液和标准系列溶液配制中，均用到了移液枪和容量瓶，实验过程中使用的移液枪经校准合格，玻璃量器具均为A级，根据其最大允差计算；实验室温度在±5℃范围内变动，温度对体积的影响可以通过体积膨胀系数进行计算。因溶液的体积膨胀系数大于容量瓶体积的膨胀，故只考虑前者的影响。水的膨胀系数为2.1×10-4℃-1，均假设为三角分布，各量器具带入的相对标准不确定度如下：合成，得到：将以上3个分量进行合成，urel（c2）为：2.2.3样品稀释体积引入的不确定度urel（V）本实验样品处理过程中，用到50mL容量瓶（A级）1次，1mL移液枪移取1.00mL溶液3次，10mL刻度移液管（A）移取9.0mL溶液1次，按照JJG196—2006《常用玻璃量器检定规程》[5]和JJG646—2006《移液器检定规程》[6]的要求，按三角分布考虑，则由量器具体积不准引入的相对标准不确定度如下。50mL容量瓶（A级）体积不准带入的相对标准不确定度：10mL刻度移液管（A级）量取9.0mL体积不准带入的相对标准不确定度：1mL移液枪量取1.00mL体积不准带入的相对标准不确定度：由量器具带入的相对标准不确定度：2.3相对标准不确定度的合成与扩展2.3.1不确定度的合成根据以上结果，将urel（m）、urel（c）、urel（V）、urel（r）进行合成，即2.3.2不确定度的扩展扩展不确定度是标准不确定度u（X）乘以包含因子k。取包含因子P95=2，则所测结果扩展不确定度：U=2×1.18mg·kg-1=2.36mg·kg-1。3结论婴幼儿奶粉中