生物化学实验 质粒DNA的提酶切与PCR鉴定 学习资料

质粒DNA的提取、

定量、酶切与PCR鉴定

/sfzx/南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心ExpertimentalTeachingCenterofBiochemistryandMolecularBiology简述实验内容流程，PCR操作步骤↓煮菌，PCR（PCR程序最后设4℃保温）↓约2小时收集PCR产物学习PCR原理质粒DNA提取（约1小时）↓紫外检测定量知识（计算方法），步骤↓紫外检测定量↓酶切步骤↓酶切约1~2小时↓学习酶切原理，琼脂糖电泳原理↓电泳（样品：质粒DNA，PCR产物，酶切产物，Marker）↓约30分钟观察电泳结果、记录、拍照、保存实验流程实验目的掌握PCR基因扩增的原理和操作方法掌握碱裂解法提取质粒的方法了解紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、方法学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作第一部分聚合酶链式反应PolymeraseChainReaction

PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA的过程。

什么是PCR？

定义

变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链加热使模板DNA在高温下90℃-95变性，双链解链降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链实验原理

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Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

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TemplateDNA5

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原理示意图

Cycle35

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25～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。PCR仪(BioRadMJmini)台式离心机、微量加样枪灭菌的薄壁离心管凝胶电泳系统凝胶成像系统

实验仪器1.菌液：大肠杆菌DH5a菌株(含靶基因CHD5片段的pMD19-T)实验材料

目的片段400bp2.引物：正向：5’GTA

AAA

CGA

CGG

CCA

GT3’

反向:5’CAG

GAA

ACA

GCT

ATG

AC3’3.2×PremixTaq：Taq酶：5U/μl4×dNTP:各10mmol/L10×缓冲液（buffer）:500mmol/LKCl，100mmol/LTris-HCl4.灭菌去离子水实验材料

(PH=8.3），MgCl2:25mM灭菌去离子水5.5l2*PremixTap12.5

l引物1-SO100(10

mol/L)1l引物2-SO101(10

mol/L)1l菌液5l总体积25

l2、取0.2mlPCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)

如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上

.实验方法

1、菌液煮沸10min,冷冻，室温解冻后离心取上清①94℃预变性5分钟后开始以下循环②94℃30秒

50℃30秒30循环

72℃1分钟③72℃5分钟④4℃保温实验过程约1小时30分钟实验方法

1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍实验方法

1、用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定;2、加5uLPCR产物进行电泳;3、预期PCR产物大小约400~500bp;结果分析

第二部分质粒DNA提取与定量ExtractionandQuantitationofPlasmidDNA独立于细菌染色体外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子；存在于细菌，放线菌，真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多．质粒（Ｐlasmid）定义

碱裂解法煮沸裂解羟基磷灰石柱层析法质粒DNA释放法酸酚法等方法

选择哪一种方法主要取决以下几个因素：质粒的大小大肠杆菌菌株裂解后用于纯化的技术和实验要求分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA分离质粒DNA三步曲分离质粒收集裂解细菌质粒扩增基本步骤

基本原理

1、碱裂解法基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异；高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性；当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉沉淀去除；2、离心层析柱基本原理

硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，不吸附蛋白质、多糖等物质；通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱；☆原理示意图（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α

（三）试剂：

LB培养基（液体、固体）AXYGEN试剂盒质粒提取试剂盒（爱思进，中国）溶液P1（S1)溶液P2(S2）溶液P3（S3）去蛋白液PE（W1)漂洗液WB(W2）洗脱液EB（Eluent)仪器材料

50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)作用：葡萄糖悬浮细胞，EDTA鳌合金属离子使DNase失活注意：菌液一定悬浮均匀，不能有结块溶液I

0.2mol/LNaOH1%SDS作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。注意：时间勿太久，动作要温柔，轻轻颠倒几次溶液II

5mol/L乙酸钠 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS＋线性DNA沉淀，Na＋可中和DNA注意：复性时间不宜过长溶液III

取1.5ml培养物加入Eppendorf管中9000rpm×30s，弃上清加入250μl溶液S1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮。加入250μl溶液S2，颠倒6～10次混匀（不要剧烈振荡），直到溶液变得清亮.加入400μl溶液S3，立即温和混匀，室温放置3-5min。13000rpm离心10min，小心取上清液（700-800μl

）。将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心3min，弃滤液。加入500μl去蛋白液(W1)，13000rpm离心1min，弃滤液，向吸附柱中加入700μl漂洗液W2，13000rpm离心1min，弃滤液。重复步骤8一次。空柱13000rpm离心2min，然后室温放置3-5min，使残留乙醇挥发。取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加60μl-100μl洗脱缓冲液(Eluent)，室温放置1min，13000rpm离心1min洗脱质粒DNA，-20℃保存备用。操作步骤

菌液离心12000rpm,1min弃上清短时离心彻底弃上清加250μl溶液P1旋涡振荡悬浮沉淀加250μl溶液P2加400μl

溶液P3颠倒颠倒数次放置3-5min离心13000rpm,10min取上清700μl加到吸附柱中离心13000rpm,1min弃滤液，加入500μl去蛋白液13000rpm,1min离心（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）（8）（9）弃滤液，加入500μl漂洗液WB（10）离心13000rpm,1min弃滤液，加入500μl漂洗液WB（11）离心13000rpm,1min弃滤液（12）离心13000rpm,2min放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加70μl洗脱液EB离心13000rpm,1min（13）-20℃保存备用操作步骤

菌体老化碱裂解不充分菌体中无质粒溶液使用不当请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养可减少菌体用量或增加溶液的用量不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。溶液Ⅱ在温度较低时可能出现浑浊，置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液。问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？

原因对策常见问题

混有蛋白混有RNA混有基因组DNA不要使用过多菌体。重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质加入RNaseA室温放置一段时间加入溶液II和III后防止剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。问题二：质粒纯度不高，如何解决？

原因对策常见问题

紫外光吸收法原理：1,物质在光的照射下会产生对光的吸收效应

2,而且物质对光的吸收是具有选择性的

3,各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱

因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系.定量检测

计算方法:因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。dsDNA(双链DNA)1OD260=50ug/mlssDNA(单链DNA)1OD260=33ug/mlRNA1OD260=40ug/ml定量检测

记录OD260值，通过计算确定DNA浓度，公式如下:质粒DNA(

g/ml)=50×(OD260)×稀释倍数

注意:我们接下来要用的eppendorf公司生产的紫外分光光度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度和Ratio值.

定量检测

根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的纯度（Ratio=A260/A280）Ratio=1.8DNA样品较纯,符合实验要求Ratio＞1.9RNA污染Ratio＜1.6

有蛋白质或其它杂质的污染定量检测

实验仪器定量检测

紫外分光光度计

比色杯

数据处理测量次数质粒DNA浓度(μg/ml)Ratio值(A260/A280)123平均值定量检测

定量检测

第二部分酶切鉴定DNARestrictionEnzymeDigestion限制性内切酶（restrictionendonuclease）是DNA操作过程中所使用的基本工具。特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。限制性内切酶

★平末端

在识别顺序的中心对称轴处切割5’G-G-C-C3’3’C-C-G-G5’5’G-G3’C-C-C-C3’-G-G5’HaeIII限制性内切酶

★3’端粘性末端

在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的3’末端切割。5’G-G-T-A-C-C3’3’C-C-A-T-G-G5’G-G-T-A-C3’CC3’C-A-T-G-GKpnI限制性内切酶

5’G-A-A-T-T-C3’3’C-T-T-A-A-G5’GC-T-T-A-A5’5’A-A-T-T-CGEcoRI★5’端粘性末端

在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5’末端切割。5’A-A-G-C-T-T3’3’T-T-C-G-A-A5’AT-T-C-G-A5’5’A-G-C-T-TAHindIII限制性内切酶

双酶切限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer；如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似的话可以考虑各取一半中和；限制性内切酶

Buffer的选择查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表

酶量的选择任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20ul。以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50μl反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外该酶可分解15μg的DNA。限制性内切酶

1.菌液：大肠杆菌DH5a菌株(含靶基因CHD5片段的pMD19-T)实验材料

目的片段400bp质粒大小为:2692bp+400bp=3092bp酶切片段大小为?影响酶切反应的因素

底物DNA的纯度：主要污染DNA的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反应;反应系统：主要是反应缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+,合适离子强度可以激发酶切反应;

反应体积：一般应尽量小，且酶切反应中甘油浓度应低于5%;保温时间与温度：温度改变会使酶识别错误;限制性内切酶

试剂名称体积(µl)无菌水9.010×M酶切缓冲液2.0质粒DNA7.0(约500ng)HindIII(15U/ul)1.0EcoRI(12U/ul)1.0总体积20.0在一个洁净的1.5mlEP管中按顺序依次加入下述试剂移液枪轻轻混匀(避免产生气泡),37℃水浴1.5h反应体系

第三部分琼脂糖凝胶电泳DNAAgaroseGelElectrophoresis天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose，约占80％）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。

定义

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动.DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).实验原理

1、DNA的分子大小

2、琼脂糖浓度

3、DNA分子的构象

4、电源电压

5、嵌入染料的存在

6、离子强度影响

影响迁移速率因素

分离范围

１.电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯青呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。

２．Gelview３．TBE４．