生物化学与分子生物学 基因诊断 学习资料

生物化学课程基因诊断GeneDiagnosis实验室诊断技术发展简史第四类20世纪80年代第三类20世纪60年代第一类基因诊断免疫学检验生物化学检查细胞学检查第二类20世纪50年代安吉丽娜·朱莉（AngelinaJolie）AngelinaJolie：Mymedicalchoice安吉丽娜·朱莉乳腺癌发病率已经从87%降至5%以下。BRCA1基因多态性：表型差异性疾病易感性药物敏感性基因变异致病（1）内源基因的变异基因结构突变基因表达异常（2）外源基因的入侵

点突变、缺失、插入易位、重排、扩增等基因变异疾病1、单基因病：血友病、地中海贫血基因变异致病2、多基因病：恶性肿瘤、高血压、动脉粥样硬化、糖尿病；多个基因的累积效应加上环境因素致病3、获得性基因病：外源性基因（如各种微生物感染）侵入个体化医疗

疾病风险预测（基因检测）

个体化治疗（基因检测）优点最有效的医疗最经济的医疗基因诊断一、基因诊断概述二、常用技术与方法三、应用概念基本原理特点临床意义第一节

基因诊断概述指利用现代分子生物学和分子遗传学方法，通过检测基因的结构或表达功能的异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法。基因水平的病因诊断基因诊断对象：DNA/RNA前提：已确定疾病表型与基因型的关系1.概念2.特点（2）灵敏度高，稳定性高：由于基因诊断采用核酸分子杂交、PCR等技术；（3）诊断范围广，适用性强：健康预警、产前诊断、疾病易感性、药物敏感性、病原体基因分型等。（1）直接检测基因，属病因诊断，特异性高；3.临床意义

对有表型出现的疾病作出明确诊断早期快速诊断确定个体对疾病的易感性疾病的分期分型、疗效监测、预后判断等症状前筛查检查对象：晚发型、高易感性、高风险性疾病或恶性肿瘤。

类型疾病名称易感、或致病基因可选择的预防、治疗措施晚发型遗甲状腺髓质瘤RET预防性手术切除传病成人型多囊肾多囊肾基因预防性手术切除、其他治疗遗传病易肝血色素病HFE预防性换血治疗感基因携静脉血栓性梗凝血因子Ⅴ避免吸烟、口服避孕药带者塞基因(R506Q)

遗传性癌遗传性乳腺癌BRCA1、BRCA2

监测、预防性手术切除

症易感基遗传性非息肉MLH1、MSH2

因肠癌(HNPCC)BRCA1

(breastcancer1,earlyonset)乳腺癌1号基因(BRCA1)，一种直接与遗传性乳腺癌有关的抑癌基因，在调节人体细胞的复制、遗传物质DNA损伤修复、细胞的正常生长、细胞凋亡等方面发挥重要作用。BRCA1、BRCA2基因突变与癌症通过对有乳腺癌家族史妇女的BRCA1和BRCA2基因突变的检测显示,此类人群中约有10%为BRCA1和BRCA2基因突变的携带者。BRCA1和BRCA2基因突变的携带者到70岁时,发生乳腺癌的风险累计达到80%-85%,一生中发生乳腺癌的风险可高达90%BRCA1和BRCA2基因突变的检测是对于有乳腺癌家族史人群进行乳腺癌筛查和早期诊断的有效方法。BRCA1、BRCA2基因突变属于常染色体显性遗传”WhatcanYOUdo?1.有家族史2.肿瘤标记物第二节

基因诊断的常用技术方法样品的核酸抽提目的序列的扩增（PCR)核酸分子杂交

（Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、点杂交、等位基因特异性寡聚核苷酸ASO、原位杂交和DNA芯片技术）基因检测分析一、基因诊断的基本步骤基本原理：核酸变性、复性（一）核酸分子杂交二、基因诊断的常用技术方法探针（probe）探针：一段能与待测核酸片段互补结合、经过特殊标记的特异核苷酸序列。制备探针的方法：基因文库法、逆转录法、人工合成法等通常为已知序列的单链核苷酸片段探针一般带有标记物探针序列的选择致病微生物核酸中最保守、最特异的序列突变基因中含突变位点或突变区的序列待测基因编码的mRNA序列核酸分子杂交的流程示意图待测核酸制备滤膜上核酸固化杂交去除未参与杂交的探针检测杂交信号制备探针核酸片段探针标记加入标记核酸探针常用的固相核酸杂交的方法

Southern印迹杂交法(Southernblotting)

Nouthern印迹杂交法(Nouthernblotting)

斑点杂交(dotblothybridization)或狭缝杂交法(slotblothybridization)

菌落杂交法(clonyhybridization)原位杂交法(nucleicacidhybridizationinsitu)EdwinMellorSouthern基本程序：1、电泳分离DNA片段2、DNA的转膜3、DNA与探针杂交4、检测杂交信号①②③④DNA印迹（Southernblotting）／原位杂交可检出被检基因的空间位置状况，即细胞的具体定位、数目及类型。体外基因扩增技术

（PolymeraseChainReaction，PCR）(二)PCR（聚合酶链式反应

）PCR基本原理变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚CPCR基本原理在体外不断进行DNA复制的过程PCR技术的优点特异性强灵敏度高操作简单、省时对待检原始材料质量要求低高效率的基因扩增技术DNA-PCRRT-PCR多重PCR(multiplexPCR）套式PCR（NestedPCR）原位PCRRealtimePCRPCR的种类PCR扩增产物分析法凝胶电泳PCR/点杂交(PCR/ASO等位基因特异性寡聚核苷酸)PCR/SSCP（SingleStrandConformationPolymorphism）

PCR/RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism,

RFLP)PCR/sequencingPCR扩增产物分析疑胶电泳分析法通过凝胶电泳检测扩增产物片段大小，若特异扩增出一条带，该法即可判断结果。注意平行对照：DNA分子量标准物阳性对照阴性对照内参照限制性酶切分析法设计的引物，使扩增片段包括某一种或数个限制酶识别序列，PCR反应后用限制酶消化扩增产物，电泳检测酶切片段长度的变化。PCR扩增产物分析

采用能与扩增产物内部核苷酸序列互补的寡核苷酸探针，实施斑点杂交或Southern印迹杂交当扩增产物出现多条带时，适用该法。核酸杂交法PCR扩增产物分析Allele-specificoligonucleotide，ASO当基因的突变部位和性质已完全明了时，人工合成两条寡核苷酸探针，其中一条与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交（N），但不能与突变基因序列杂交；另一条与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交（M)，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来.

PCR/ASO等位基因特异寡核苷酸（ASO)探针杂交PCR扩增产物分析PCR/ASOPCR扩增产物分析通过PCR同时扩增待测基因和野生型对照基因的DNA片段，将扩增的双链DNA变性成单链，用非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。待测基因的单链DNA上单个碱基的改变可导致构象的改变，其电泳迁移率也会发生改变。通过比较这两者的迁移率，即可判断是否发生基因突变。PCR/单链构象多态性分析正常人纯合突变杂合突变PCR/SSCP分析+—PCR扩增产物分析PCR结合序列分析不仅可以检出有无突变，还能检测突变的具体位置和突变类型、获得碱基组成和顺序改变的详细信息。PCR/Sequencing（三）

DNA多态性分析人群中不同个体间基因的核苷酸序列存在着差异性，称为DNA的多态性，是生物多样性的遗传基础。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。RFLP分析法（1）限制性酶切图谱直接分析法

PCR/RFLP（2）RFLP间接分析法

PCR/RFLP连锁分析法DNA多态性的发生可导致限制性内切酶识别位点的增加、缺失或易位，使DNA分子的限制性酶切位点数目、位置发生改变。用限制酶切割基因组时，所产生的限制性片段的数目和每个片段的长度就不同，即所谓限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）限制性内切酶酶谱分析原理：某些疾病的发生是由于基因内单一碱基的改变引起，当此突变正好发生在限制性内切酶识别位点时，会导致内切酶图谱的改变，根据这一改变，综合其它因素，可对疾病的发生诊断。MSTII识别位点：CCTNAGG正常

-珠蛋白基因：5’－CCTGAGG－3’镰刀型贫血：5’－CCTGTGG－3’实例分析：

镰刀型红细胞性贫血MMMMM正常－Hb镰刀型贫血－Hb1.1kb0.2kb1.3kbAAASSS1.3kb1.1kb0.2kbDNA重复序列多态性分析可变数目的串联重复序列（variablenumberoftandemrepeat,VNTR）：

一种特殊的串联重复，在不同个体和基因组的不同位点上数目都不同。在人类中VNTRs位点是1－5kb的序列，此序列由长15-100nt的重复单位组成。小卫星DNA；DNA指纹法短串联重复序列(shorttandemrepeat,STR):1~4bp，微卫星DNA数量多、分布均匀、易于检测（四）DNA芯片技术

DNAchipsormicroarray基因芯片技术的流程BiologicalSampleAnalyzedataScannermicroarray“Hybridize”arrayer

MicroarrayfabricationSamplepreparationMolecularhybridizationDetectionandanalysis基因芯片打印仪DNA序列分析基因突变检测及多态性分析基因表达谱分析基因诊断新药研发及药物筛选基因芯片基因芯片技术的应用基因芯片技术的优势微型化和自动化高度平行性巨大的信息产出率高度敏感性和专一性强大的类比性（五）基因测序最直接、最准确第三节

基因诊断的应用基因诊断的应用

遗传疾病的基因诊断（产前、产后诊断）

感染性疾病的基因诊断（早期诊断）

肿瘤的基因诊断（分类分型与预后监测）基因诊断在法医学的应用（个体识别、亲子鉴定）判断个体疾病易感性器官移植组织配型(一)遗传性疾病基因诊断直接基因诊断的前提是被检测基因必须已被克隆，基因的正常顺序和结构已被阐明，致病突变也已经清楚。直接诊断策略检测已知的致病基因较长的DNA片段的突变：Southernblot已知点突变：RFLP,PCR/ASO未知点突变：PCR/SSCP先寻找点突变，再用序列分析2.间接诊断策略：

检测与致病基因连锁的遗传标记限制性片段长度多态性、微卫星DNA序列和单核苷酸多态性（SNP)。寻找具有基因缺陷的染色体，并判断被检者是否具有这条染色体。(一)遗传性疾病基因诊断预测性遗传筛查在个体的不同时期，针对不同对象进行新生儿筛查以便早诊断、治疗和预防育龄(婚前)对象筛查对发现严重疾病基团携带者进行发病风险估计，防止遗传病发生在后代。产前筛查和产前诊断提供终止患病胎儿继续发育的选择。预植入基因诊断(PGD)，又称受精卵子宫着床前诊断，是针对体外授精、试管婴儿等辅助生殖技术的基因诊断。(二)感染性疾病的基因诊断核酸分子杂交PCRDNA芯片技术外源基因的检测潜伏期内诊断，病原体分类、分型鉴定病原微生物流行病学筛查(三)肿瘤的基因诊断1.肿瘤相关基因的检测

（1）检测肿瘤相关基因的突变癌基因、抑癌基因、肿瘤转移基因、肿瘤转移抑制基因等

（2）检测肿瘤相关病毒的基因①与鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤有关的EB病毒②与宫颈癌有关的人类乳头瘤病毒（HPV）③与肝癌有关的HBV、HCV

（3）检测肿瘤标志物基因2.肿瘤相关基因表达谱分析肿瘤的早期基因诊断(四)基因诊断在法医学中的应用通过人类遗传基因分析来判断父母与子女是否亲生关系，称之为亲子鉴定。亲子鉴定方法

目前国内外进行亲子鉴定的试验手段主要有：

①血型检验（人类白、红细胞抗原分型）②DNA多态性检验亲子鉴定DNA指纹法（DNAfingerprints）提取人基因组DNA，用限制性内切酶切成不同长度的片段（各种VNTRs上都没有酶切位点），然后以VNTRs中的特异序列为探针进行Southern杂交，可发现阳性片段的长度各不相同。由于不同个体的这种串联重复的数目和位置都不相同，所以VNTRs的So