《动物实验技术》课件-任务1：动物组织石蜡切片的制备

动物实验技术石蜡组织切片的制备组织石蜡切片的制备WilliamOsler什么是病理学与病理技术病理学（Pathology）是研究疾病的病因、发病机制、病理变化结局与转归的医学科学；帮助人类了解疾病的发生发展规律,阐明疾病本质；同时病理学科也是基础医学与临床医学的桥梁。病理技术是病理学的一个重要分支，是病理学研究中的方法学，是病理诊断的基础。病理学乃医学之本组织石蜡切片的制备一张制备良好的病理切片是病理学检测、研究的重要工具与基础。那如何制备病理切片呢？由于生物样品各种组织成分不同，因此性质也各异，如软硬程度，疏松、致密程度，面积大小等都不相同，自然状态下要将它们切成十几微米甚至几个微米的薄片，几乎是办不到的。组织石蜡切片的制备一张制备良好的病理切片是病理学检测、研究的重要工具与基础。那如何制备病理切片呢？包埋(embedding)就是将某些特殊的支持物质浸入到组织块内部，利用支持物质的物理特性，如由液态转变成固态，使整个组织具有均匀一致的固态结构和足够的硬度，以利于用切片机制取极薄的切片。组织石蜡切片的制备石蜡切片技术冰冻切片技术将大块的组织制成薄薄的切片，配合多项染色技术，用于后续检测、诊断等组织石蜡切片的制备利用石蜡(paraffin)作为包埋剂，将浸过蜡的组织块置于石蜡内制成蜡块，是组织学切片技术中最常用的一种包埋方法。石蜡切片能使组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值。组织石蜡切片的制备石蜡切片优点：组织结构保存良好，能切连续薄片。组织结构清晰，抗原定位准确。可长期保存。缺点：制片过程中要经过酒精、二甲苯等有机溶剂处理，组织内抗原活性失去较多。解决方式：抗原热修复---柠檬酸盐缓冲液高温煮30min(有效去除醛类固定剂导致的蛋白之间的交联，充分暴漏石蜡切片等，样品中的抗原表位，从而大大改善免疫染色效果)。组织石蜡切片的制备把固定后的组织或未经固定的新鲜组织，不经乙醇脱水、透明、浸蜡等一系列复杂的处理，直接液氮速冻变硬进行切片。冰冻切片是以聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物（OCT）为包埋剂、以水作为支持物质，包埋组织标本和进行切片。由于组织不经有机溶剂的处理，不受浸蜡、包埋时高温影响，所以能较好地保存各种酶、抗原的活性及脂肪、类脂的结构。组织石蜡切片的制备冰冻切片的制作过程简单，一般只需几十分钟便可制成；在冰冻过程中，组织中水分易形成冰晶，往往影响抗原定位，同时冰冻切片比石蜡切片要厚，一般8-80μm，且清晰度较差；切片过程中易碎易烂，不能用于回顾性研究，切片标本只能低温短期保存。组织石蜡切片的制备遵循病理岗位工作流程对标国家卫生专业技术资格重点讲解组织石蜡切片制备流程与注意事项组织石蜡切片的制备病理岗位工作流程取材与固定洗涤脱水透明包埋切片浸蜡对标国家卫生专业技术资格：病理学技术士

一、取材与固定思前想后组织在固定液中照片实验动物取材照片复习组织取材操作注意事项；复习组织固定原理、常用固定液配方、固定流程与注意事项；检查本组在上一任务中完成的组织固定情况，观察有何变化并分享交流。二、洗涤固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果多数用流水冲洗不同固定液应选择不同洗涤液或方法进行洗涤三、脱水组织在固定液长时间浸泡后，会含大量的水分，为了制片和长时间保存，必须将水分置换成石蜡；为什么要对组织进行脱水？水和石蜡互不相容，但水溶于乙醇，而乙醇和石蜡都可以溶于二甲苯，所以利用乙醇和二甲苯作为媒介，最终将组织中的水分替换成石蜡；组织突然进入高浓度乙醇会发生收缩和变形，不利后续包埋、切片、染色，因此要从低浓度乙醇到高浓度乙醇中依次进行。四、透明透明：脱水过程中，水分被乙醇取代，乙醇被石蜡的媒浸液取代，如二甲苯；而二甲苯与玻璃的折光率非常接近，采用光学显微镜观察，感觉组织块变得透亮，因此称之为透明，同时二甲苯也称为透明剂。透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及属于囊腔抑或实质器官而定；如果透明时间过短，则透明不彻底，石蜡难于浸入组织；透明时间过长，则组织硬化变脆，就不易切出完整切片，透明总时间不超过3h。五、浸蜡用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用，此过程为浸蜡过程。通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小时，五、浸蜡再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。五、浸蜡用梯度浓度乙醇将组织内水分置换出来二甲苯将组织内乙醇置换出来（透明）用石蜡将组织内二甲苯置换出来（浸蜡）透明浸蜡过程：组织脱水透明浸蜡包埋和切片五、浸蜡75%酒精4h85%酒精2h90%酒精2h95%酒精1h无水乙醇I30min无水乙醇II30min醇苯5-10min二甲苯I5-10min二甲苯II5-10min蜡I1h蜡II1h蜡III1h六、包埋包埋：是将某些特殊的支持物质浸入到组织块内部，利用支持物质的物理特性，将整个组织加以包埋，最后凝固成均匀一致的较硬固态结构，以便切片机制备极薄切片。1.先将融化的蜡放入包埋框，设定包埋机参数；将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋；具体流程：2.取预热包埋框及金属板，搭成包埋模具；倾注少量熔蜡于包埋框中；从蜡杯中夹取组织块，切面向下置于框底；加熔蜡至包埋框上缘，注意标签；3.于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。六、包埋注意：1.准备包埋蜡：一般应用硬蜡（56~58℃或60~62℃）为好，所用的石蜡要求透明无杂质，新的石蜡要反复熔凝，并有一定的粘韧性；蜡的熔点应与组织的硬度相适应；包埋用过的石蜡可以反复使用；六、包埋注意：2.包埋用蜡的温度应略高于浸蜡温度，保证组织块与周围石蜡完全融为一体；3.石蜡的迅速冷却非常重要，否则包埋块中将会产生结晶。以后切片时引起碎裂。七、切片1.将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上；2.将切片刀固定在刀夹上，刀口向上；3.摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口；4.调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右；5.调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4-10μm；七、切片6.一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40-50r/min为宜；7.切成的蜡带到20-30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上；七、切片8.用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好；9.切片工作结束后，应将切片刀取下，擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。七、切片切片是石蜡切片制备的关键环节易出现多种问题八、展片与贴片安装切片刀片并做好防护；将蜡块固定于切片机上，调整方向、角度、切片厚度等参数；再将一定长度蜡带（连续切片）或用刀片断开成单个蜡片于温水（45℃左右）中展平后，捞至涂有防脱