高三一轮复习生物：酶专题复习（基因工程部分）（教学课件）

课前任务：以“酶”为中心，参考高中生物5本书内容，绘制思维导图

浙科版二轮复习“细胞的代谢”——酶2.有些RNA可通过降低化学反应的活化能来提高反应速率。（

）4.酶可以通过食物直接获取。（

）1.酶在反应过程中可以为反应提供活化能。（

）酶的化学本质大多数蛋白质，少数是RNA，食物中的酶需经过胃蛋白酶等作用分解成氨基酸，从而被人体吸收。5.探究胃蛋白酶的最适pH时，将其加入蛋清中再加入缓冲液。（

）3.酶具有高效性的机理，就是酶降低了化学反应所需的活化能。（

）8.解旋酶、DNA聚合酶、ATP合成酶均可通过核孔从细胞质运输到细胞核内。（

）6.酶的专一性与酶的活性中心和底物分子在空间结构上有特殊的匹配关系相关。（

）7.唾液淀粉酶催化反应的最适温度和保存温度都是37℃。（

）×√×××√××酶催化的实质酶本质酶的来源酶的催化过程酶的影响因素酶特性基因工程实验室实习日记之探索酶的奥秘——第一课时“欢迎各位实习研究员加入基因工程实验室！本周我们的任务是完成‘抗病毒小麦’的基因工程改造项目。实验流程包括：切割目的基因、构建重组DNA、扩增基因片段、检测成果。但实验手册被意外损坏，需要你们通过分析酶的功能，重建实验步骤。”关卡1：切割目的基因——限制酶的作用Q1:切割DNA的工具是什么？它的作用部位和结果是什么？限制性内切核酸酶实验室提供了抗病毒基因片段和质粒，但如何精准切割它们？断开两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，形成黏性末端或平末端EcoRI是一种限制酶，其识别序列是GAATTC，切割点是G与A之间的磷酸二酯键关卡1：切割目的基因——限制酶的作用Q2:选择限制酶需要注意什么？不破坏目的基因原则保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则实验室提供了抗病毒基因片段和质粒，但如何精准切割它们？关卡1：切割目的基因——限制酶的作用Q3:为何通常选择不同的限制酶进行切割？防止目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接实验室提供了抗病毒基因片段和质粒，但如何精准切割它们？关卡1：切割目的基因——限制酶的作用Q4:若质粒用EcoRⅠ切割后产生黏性末端，目的基因用SmaⅠ切割后为平末端，能否直接连接？为什么？如何才能连接？1.黏性末端和平末端之间缺乏互补性，无法自然配对。2.平末端连接没有方向性，可能导致插入片段的随机插入。实验室提供了抗病毒基因片段和质粒，但如何精准切割它们？3次PCR后得到平末端，然后再连接关卡2：构建重组DNA——DNA连接酶的选择Q1:两种DNA连接酶的作用范围有何差异？切割后的质粒与目的基因需要连接，但实验室有T4DNA连接酶和E.coliDNA连接酶，如何选择？T4DNA连接酶：可以连接黏性末端和平末端，还能连接DNA与RNA之间的磷酸二酯键。依赖ATP作为辅因子，反应温度范围较宽。E.coliDNA连接酶：对黏性末端的连接效率较高，但无法有效连接平末端。依赖NAD作为辅因子。反应温度为37℃。关卡2：构建重组DNA——DNA连接酶的选择Q2:DNA连接酶与DNA聚合酶都能形成磷酸二酯键，为何不能互相替代？切割后的质粒与目的基因需要连接，但实验室只有T4DNA连接酶和E.coliDNA连接酶，如何选择？作用于氢键作用于磷酸二酯键DNA解旋酶DNA聚合酶关卡3：扩增基因片段——PCR技术与DNA聚合酶Q1:PCR技术中，高温使DNA解链后，若用普通DNA聚合酶进行体外复制会失败，原因是什么？Taq酶的优势何在？重组质粒需大量复制。在PCR反应中，DNA变性步骤需要在94℃~95℃的高温下进行，而普通DNA聚合酶在这种高温条件下会迅速失活，Taq酶是从嗜热菌（Thermusaquaticus）中分离出来的DNA聚合酶，能够在90℃以上的高温环境中保持活性，不会因高温变性而失活。Q2:温度如何影响酶的活性？温度过高会破坏酶的空间结构，无法恢复，导致永久失活关卡4：检测成果——逆转录酶的应用Q1:如何将mRNA转化为可检测的DNA片段？需要哪种酶？得到的DNA片段需要通过什么过程进行分离纯化？检测发现小麦细胞中病毒抗体蛋白含量较低，怀疑基因未成功转录。该如何设计实验来验证？逆转录酶Q2:画出中心法则示意图

琼脂糖凝胶电泳DNA解旋酶、DNA聚合酶RNA聚合酶逆转录酶RNA复制酶最终关卡下列是完整的“抗病毒小麦”实验流程，请标注各环节关键酶的名称与作用步骤各环节的关键酶作用切割目的基因限制酶断开相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键构建重组DNADNA连接酶连接脱氧核苷酸片段之间的磷酸二酯键扩增基因片段DNA聚合酶连接相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键检测成果逆转录酶将RNA逆转录成DNA，便于扩增和检测为研究果蝇K基因的功能，科研人员运用CRISPR基因编辑技术“敲除”了K基因。(1)CRISPR系统由向导RNA和Cas9核酸酶组成，向导RNA可与DNA的一条链通过

原则结合，Cas9酶能将与之结合的双链DNA切割，如图1所示。Cas9酶与基因工程使用的限制酶作用的差异是

。

碱基互补配对Cas9核酸酶不具有识别DNA分子中特定核苷酸序列的作用，切割的是与向导RNA结合的DNA中的磷酸二酯键，使DNA双链断裂；限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，切割的是DNA每一条链中特定部位的磷酸二酯键，使DNA双链断裂为研究果蝇K基因的功能，科研人员运用CRISPR基因编辑技术“敲除”了K基因。(2)为后续筛选K基因“敲除”的果蝇，在K基因DNA断裂位点插入红色荧光蛋白基因（RFP）需提供携带有红色荧光蛋白基因的供体质粒。①应选用

处理图2所示的质粒和红色荧光蛋白基因，以构建供体质粒，同时避免质粒自连。BamHI、NotI为研究果蝇K基因的功能，科研人员运用CRISPR基因编辑技术“敲除”了K基因。②将Cas9酶基因、向导RNA基因和供体质RFP基因粒导入果蝇的

中，若检测到红色荧光，则表明K基因可能被成功“敲除”，该受精卵发育成的果蝇即为F₀代果蝇。受精卵(3)为确认K基因是否被成功“敲除”，科研人员进行了如下实验：①科研人员用图3中的引物I、II、III对F₀代果蝇DNA进行PCR并电泳检测（大于10kb片段单次PCR无法完成扩增）。若敲除成功，则观察到的不同个体电泳条带可能有两种情况：

或

（长度单位：kb），出现这两种情况的原因是

。4kb（或3.5kb）4kb和5.5kb（或3.5kb和5.5kb）RFP序列按图中方向正向插入断裂区域，敲除成功的F0代果蝇可能是敲除杂合体或纯合体、或敲除成功的F0代果蝇插入了一个或两个RFP基因（或者RFP序列按图中方向反向插入断裂区域，敲除成功的F0代果蝇可能是敲除杂合体或纯合体、或敲除成功的F0代果蝇插入了一个或两个RFP基因）(3)为确认K基因是否被成功“敲除”，科研人员进行了如下实验：②近年来，科研人员又发现了一种检测基因的方法——Cas12a酶法。该酶类似Cas9能够在向导RNA的作用下，在特定位点剪切目标DNA之后，还发挥非定向切割单链DNA的功能（如图）。用该方法检测敲除是否成功并排除“脱靶”的方法是：利用

序列设计向导RNA，取待检测细胞克隆导入

和报告分子，观测指标是

。

目标DNA向导RNA基因和Cas12a酶基因是否产生绿色荧光基因工程实验室实习日记之探索酶的奥秘——第二课时特殊关卡：扩增基因片段Q1:实验室PCR仪突发故障，重组质粒需大量复制，可用什么替代方案？重组质粒需大量复制，但实验室PCR仪突发故障！请设计替代方案。用普通DNA聚合酶代替RPA技术特殊关卡：扩增基因片段Q2:利用以下材料和设备，探究不同温度条件下普通DNA聚合酶的活性变化，确定其最适温度范围。重组质粒需大量复制，但实验室PCR仪突发故障！请设计替代方案。材料：DNA聚合酶，反应缓冲液（包含MgCl₂、Tris-HCl等成分），dNTP混合液，引物对，DNA模板，其他试剂（BSA牛血清白蛋白、EDTA（作为反应终止液））等。实验设备：恒温水浴锅、离心管、移液器、电泳仪等。Q2:利用以下材料和设备，探究不同温度条件下DNA聚合酶的活性变化，确定其最适温度范围。重组质粒需大量复制，但实验室PCR仪突发故障！请设计替代方案。步骤：1.配制若干适量且等量的反应体系，包括反应缓冲液、dNTP混合液、引物、DNA模板和DNA聚合酶。2.设定不同的温度梯度，将配制好的反应体系分别置于不同温度的恒温水浴锅中。3.在每个温度下反应一段时间，反应结束后，加入终止液终止反应。4.通过琼脂糖凝胶电泳检测反应产物的生成情况，记录不同温度下产物的量和质量，以评估酶活性。特殊关卡：扩增基因片段Q2:利用以下材料和设备，探究不同温度条件下DNA聚合酶的活性变化，确定其最适温度范围。重组质粒需大量复制，但实验室PCR仪突发故障！请设计替代方案。步骤：1.配制若干适量且等量的反应体系，包括反应缓冲液、dNTP混合液、引物、DNA模板和DNA聚合酶。2.设定不同的温度梯度，将配制好的反应体系分别置于不同温度的恒温水浴锅中。3.在每个温度下反应一段时间，反应结束后，加入终止液终止反应。4.通过琼脂糖凝胶电泳检测反应产物的生成情况，记录不同温度下产物的量和质量，以评估酶活性。实验设计：1、取材、分组并编号2、对照处理、控制单一变量3、适宜条件下培养一段时间4、检测结果，分析并处理数据特殊关卡：扩增基因片段Q3:根据电泳结果，绘制表格，酶活性可用什么检测指标呈现？分析不同温度下的条带特点，确定酶的最适温度范围。温度产物条带亮度产物条带清晰度酶活性评估25弱不清晰28弱不清晰31中等清晰34中等清晰37强清晰40最强最清晰43弱不清晰46弱不清晰4037343128254346实验结果表示提升关卡：拓展应用1.表格法变量（浓度、温度、光照强度等）对照组实验组C0C1C2C3…………12……平均值……12……平均值…………自变量因变量标题：×××××单因子变量温度产物条带亮度产物条带清晰度酶活性评估25弱不清晰28弱不清晰31中等清晰34中等清晰37强清晰40最强最清晰43弱不清晰46弱不清晰实验结果表示提升关卡：拓展应用1.表格法单位时间内底物的消耗量提取液的pH6.06.26.46.66.87.07.27.47.67.88.0酶保护剂的浓度0.020.030.040.050.06探究酶保护剂的最适浓度和提取液的最适pH的对酶活性影响实验结果记录表自变量自变量因变量多因子变量实验结果表示提升关卡：拓展应用2.曲线法①建标：确定坐标轴；标注单位和数值。(自变量，因变量）②描点：根据题目所给数据描点，有时要对数据进行必要的处理。③