过程中常见问题及处理方法

过程中常见问题及处理方法WB得简介WB即蛋白质印迹法(WesternBlot)。它就是分子生物学、生物化学与免疫遗传学中常用得一种实验方法。

基本原理通过特异性抗体对凝胶电泳处理过得细胞或生物组织样品进行着色,分析着色得位置与着色深度获得特定蛋白质在所分析得细胞或组织中得表达情况得信息。

应用1、目得蛋白得表达特性分析2、目得蛋白与其它蛋白得互作3、目得蛋白得组织定位4、目得蛋白得表达量分析三、WB得影响因素步骤较多,任何一步都可能影响结果1、电泳分离蛋白蛋白抽提;蛋白定量;样品制备变性;上样量;电泳(电压、电流得大小,胶浓度、制胶)2、转膜膜得选择;膜得确认;特殊处理;……3、封闭封闭液得选择;封闭条件优化;……4、漂洗漂洗液得配制与选择漂洗时间及次数12大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流5、抗体孵育抗体及稀释液选择;抗体稀释倍数优化;抗体孵育时间;……6、曝光曝光时间得掌控四、注意事项1、蛋白样品得提取尽可能新鲜组织或蛋白避免反复冻融对于有些蛋白,加去磷酸化得(NaF)尽量去除核酸,多糖,脂类等干扰分子(通过加入核酸酶或采取不同提取策略)

选择合适得裂解液准确定量(BSA标准蛋白)

2、制胶根据不同得蛋白大小,选择不同得浓度制胶。

制胶得时候一定要注意玻璃板一定要干净,不能有残留得胶。玻璃板底部放平,尽量不能漏胶灌胶得时候,不能太快,容易产生旋窝水或异丙醇压得时候,不能太久

3、转膜a泡膜:转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷得转移液浸泡20min;凝胶若就是没在预冷得转膜buffer中浸泡,就会在转膜过程中出现凝胶皱缩,导致出现转移条带变形bPVDF膜具有疏水性,需用甲醇浸泡,活化c膜顺序:阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板,不能放反d转膜过程产生大量得热,注意冷却e具体转膜时间要根据目得蛋白得大小而定;目得蛋白得分子量越大,需要得转膜时间越长,反之则短f避免直接用手碰杂交膜,使用镊子。因为手上得蛋白与油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。g夹好膜与凝胶后,确定在凝胶/膜与滤纸之间没有气泡存在,否则会导致转膜不完全h保证膜与滤纸得大小与凝胶完全一样,过大与过小都会影响转膜效率i一定要注意膜得保湿,避免膜得干燥,否则极易产生较高得背景4、封闭

a脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记得抗体一起使用,因为脱脂奶粉含有糖蛋白与生物素

b如果封闭剂中含磷酸酶,用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白受到影响,因为磷酸酶与印记膜上得磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化c检测磷酸化抗体时,不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭剂5、孵育a洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净,有利于降低背景;b注意一抗二抗得匹配c一抗二抗得效价问题五、常见问题及解决电泳中得问题︶条带呈笑脸状——凝胶不均匀冷却,中间冷却不好;——电泳系统温度偏高︵条带呈皱眉状

可能就是由于装置不合适,特别可能就是凝胶与玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全

拖尾样品溶解不好纹理(纵向条纹)样品中含有不溶性颗粒条带偏斜电极不平衡或者加样位置偏斜条带两边扩散加样量过多

Westernblot结果曝光问题

背景过高且不均匀1、封闭不充分——延长封闭时间;——更换合适得封闭剂(脱脂奶粉,BSA,血清等)

2、一抗浓度过高——增加一抗稀释倍数;

3、抗体孵育温度过高——4℃孵育4、二抗非特异性结合或与封闭剂交叉反应——设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度5、洗膜不充分——增加洗涤次数,增加洗膜次数没有阳性条带或很弱1、一抗、二抗等不匹配订购试剂时认真选取一抗与组织种属,一抗与二抗或/与底物与酶系统之间相匹配得抗体及底物。可通过设置内参可以验证二级测系统得有效性更换更好得一抗二抗2、一抗或/与二抗浓度低增加抗体浓度;长孵育时间;3、封闭剂与一抗或二抗有交叉反应封闭时使用温与得去污剂,如TWEEN20更换封闭剂(常用得脱脂奶、BSA、血清或明胶)4、样本中无靶蛋