水产品中氯霉素检测技术规范FDIS

B50DB1302唐山市质量技术监督局发布DB1302/T374—2013本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由唐山市质量技术监督局提出。本标准起草单位：唐山市畜牧水产品质量监测中心。本标准起草人：郑百芹、蒙君丽、张建民、葛怀礼、董李学、刘洋、周鑫、吴颖、肖琎、李玉文、张荣华、牛惠超。DB1302/T374—2013水产品中氯霉素检测技术规范本标准规定了水产品中氯霉素的胶体金免疫层析测定方法、酶联免疫吸附测定方法和高效液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于水产品中氯霉素残留的快速集成检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单或修订版）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规则和试验方法SC/T3016水产品抽样方法农业部781号公告-2-2006动物源食品中氯霉素残留量的测定高效液相色谱-串联质谱法农业部1025号公告-26-2008动物源性食品中氯霉素类残留检测酶联免疫吸附测定法3抽样方法按照SC/T3016执行。4胶体金免疫层析法4.1适用范围本方法适用于水产品中氯霉素的快速筛选检测，最低检测浓度1µg/kg。4.2方法原理胶体金快速检测试纸条采用竞争抑制免疫层析原理。若样品中含有氯霉素，氯霉素与金标抗体相结合，封闭金标抗体上的抗原结合点，阻止金标抗体与纤维素膜上氯霉素偶联物结合，显色较弱或不显色；若样品中不含有氯霉素，则不能阻止金标抗体与纤维素膜上的氯霉素偶联物结合，显色较强。4.3试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂，水为符合GB/T6682规定的三级水。4.3.1吸管、缓冲液、氯霉素检测条(试剂盒自带)，4℃~30℃阴凉避光干燥处储存。4.3.2乙酸乙酯4.3.3正己烷4.4仪器和设备4.4.1组织匀浆机4.4.2天平：感量（0.01g）4.4.3振荡器或混旋器4.4.4微量移液器：单道20µL～200µL、100µL～1000µL4.4.5计时器4.4.6吹风机2DB1302/T374—20134.5样品前处理称取已均质样品1g(±0.05g）于l5mL离心管中，加入1mL乙酸乙酯，振荡器震荡混匀，静置5min；移液枪吸取澄清液(约300µL～400µL)于50mL锥底离心管中，吹风机冷风吹干；用0.3mL正己烷溶解残渣，加入0.3mL缓冲液，振荡器振荡1min，静置3min，供测试用。4.6检测和结果判定4.6.1检测取出检测条，平放，用移液枪或塑料吸管取待测液80µL(2～3滴)于加样孔，10min～15min内观察结果，目测检测线。4.6.2结果判定结果判定如图1所示。其中C线为质控线，T线为检测线。4.6.2.1C线和T线均呈现肉眼可见红色线为阴性。4.6.2.2T线无显色，C线呈现肉眼可见红色线为阳性。4.6.2.3C线和T线无显色或只出现T线，C线无显色的为无效。待测条阴性阳性无效图1检测结果判定5酶联免疫吸附法5.1适用范围本方法适用于水产品中氯霉素的快速筛选检测，最低检测浓度0.25µg/kg。5.2方法原理采用ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被氯霉素抗体，样品中残留的氯霉素和酶结合物竞争氯霉素抗体，TMB底物显色，样品吸光度值与含氯霉素含量负相关。通过标准曲线计算样本浓度，再乘以其对应的稀释倍数，即可得到样品中氯霉素的含量。5.3试剂和材料以下所用的试剂，除特殊注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的二级水。5.3.1氯霉素酶联免疫检测试剂盒5.3.2乙酸乙酯5.3.3正己烷3DB1302/T374—20135.3.4复溶液（试剂盒自带）5.4仪器设备5.4.1微孔板酶标仪（配备450nm/630nm滤光片）5.4.2均质器5.4.3振荡器5.4.4涡旋仪5.4.5离心机（转速3000r/min）5.4.6天平（感量0.01g）5.4.7微量移液器：单道20µL～200µL、100µL～1000µL5.4.8氮气吹干装置5.5样品前处理按照农业部1025号公告-26-2008方法进行样品前处理。5.6样品检测5.6.1测定条件:将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20℃~25℃)平衡3每种液体试剂使用前均须摇匀。5.6.2编号：将氯霉素标准溶液和待测样品对应微孔按序编号，每个标准溶液和待测样品均做重复孔。5.6.3加样：加入标准溶液/样品50µL，然后每孔分别加入氯霉素酶标记物溶液50µL。5.6.4温育：轻轻振荡混匀，用封板膜封板后置于室温（20℃~25℃)反应30min。5.6.5洗涤：揭开封板膜，每孔加入稀释后的洗涤液250µL，连续洗板3次，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头戳破）。5.6.6显色：加入底物溶液A50µL和底物溶液B50µL，振荡混匀，25℃避光显色20min。5.6.7测定：加入终止液50µL，轻轻振荡混匀，在5min内于450nm处用酶标仪测定吸光度值。5.7结果判定5.7.1计算B/B0百分吸光度值（%）=×100%式中：B—标准溶液或待测样品溶液的吸光度值；B0—0号标准溶液的吸光度值。5.7.2绘制标准曲线，计算样品中氯霉素浓度以氯霉素标准溶液浓度为X轴，对应的百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样品中氯霉素的浓度。氯霉素含量(μg/kg)＝C×0.5式中：C：待测液中氯霉素的含量(μg/kg0.5：样品稀释倍数。6高效液相色谱-串联质谱法6.1适用范围本方法适用于水产品中氯霉素的确证检测，检出限为0.1μg/kg，定量下限为0.2μg/kg。DB1302/T374—20136.2方法原理采用间位氯霉素作内标，试料依次用乙腈、40g/L氯化钠去蛋白，正己烷脱脂，乙酸乙酯提取，固相萃取柱净化，氮气吹干。用高效高效液相色谱-串联质谱法测定，间位氯霉素内标法定量。6.3试剂和材料除方法另有规定外，试剂均为分析纯，实验室用水符合GB/T6682中一级水的规定。6.3.1氯霉素标准品(CAP)6.3.2甲酸：色谱纯6.3.3内标：间位氯霉素(m-CAP)或氘代氯霉素（CAP-D5）6.3.4乙腈：色谱纯6.3.5氯化钠6.3.6正已烷6.3.7乙酸乙酯6.3.8氢氧化钠溶液：5mol/L6.3.9甲醇：色谱纯6.3.1040g/L氯化钠溶液：称取氯化钠4.Og，用水溶解并稀释至100mL，临用前配制。6.3.11水饱和乙酸乙酯溶液：取400mL乙酸乙酯于500mL棕色试剂瓶中，加水50mL，加盖、振摇静置，使用时取上层溶液。6.3.12乙腈饱和的正己烷：取100mL乙腈和100mL正己烷混合，振摇静置，使用时取上层溶液。6.3.13氯霉素标准储备液：精密称定氯霉素标准品10mg，置于100mL容量瓶中，甲醇超声溶解并稀释成浓度为100μg/mL。-20℃保存，有效期1年。6.3.14间位氯霉素内标储备液：精密称定间位氯霉素10mg，置于100mL容量瓶中，甲醇超声溶解并稀释成浓度为100μg/mL。-20℃保存，有效期1年。6.3.15氯霉素标准工作液：准确量取标准储备液适量，用流动相稀释成浓度为10ng/mL、50ng/mL的标准工作液。4℃保存，有效期3个月。6.3.16间位氯霉素内标工作液准确量取内标储备液适量，用流动相稀释成浓度为20ng/mL的内标工作液。4℃保存，有效期3个月。6.3.17C18固相萃取柱(500mg/3cc)6.3.18有机滤膜：0.22μm6.4仪器和设备6.4.1高效液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾电离源6.4.2离心机：最高转速大于等于6000r/min6.4.3旋转蒸发仪6.4.4天平感量为0.0001g）6.4.5分析天平感量0.00001g）6.4.6微量移液枪：20µL～200µL、100µL～1000µL、1mL～5mL6.4.7固相萃取装置6.4.8涡旋振荡器6.4.9粉碎机5DB1302/T374—20136.5试样制备试料的制备包括：——取绞碎后的供试样品，作为供试试料。——取绞碎后的空白样品，作为空白试料。——取绞碎后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。6.6操作方法6.6.1提取取10000r/min匀浆1min的供试试料5g(±0.02g)置50mL离心管中，加1μg/mL间位氯霉素内标工作液10µL，加乙腈5mL，40g/L氯化钠溶液5mL，涡旋振荡2min，6000r/min离心10min，取上清液至另一50mL离心管中，重复提取1次，合并提取液。提取液中加乙腈饱和的正己烷5mL，涡旋振荡1min，6000r/min离心10min，弃去上层液，重复1次。加水饱和乙酸乙酯溶液5mL，涡旋振荡lmin，6000r/min离心5min，将上层液转移到100mL鸡心瓶中，重复提取1次，合并提取液，45℃旋转蒸干，残渣用水-乙腈(40：60)3mL溶解，备用。6.6.2净化固相萃取柱依次用甲醇10mL，水10mL预洗，取备用液过柱。用水3mL洗柱，洗2次后，用流动相4mL以1mL/min的速度将样品洗脱入15mL离心管中。洗脱液中加水饱和乙酸乙酯溶液4mL，涡旋振荡1min，2000r/min，离心5min，取上层液，重复提取1次，合并提取液，氮气流下吹干。用流动相1.0mL溶解残余物后，涡旋震荡1min，过0.22μm滤膜，供高效液相色谱-串联质谱测定。6.6.3空白试验取空白试料，按6.6.1和6.6.2操作。6.6.4标准曲线的制备精密量取氯霉素标准工作液和间位氯霉素