土壤质量 土壤微生物多样性的测定 第2部分：磷脂脂肪酸分析法 征求意见稿

1GB/ZXXXXX—XXXX土壤质量土壤微生物多样性的测定磷脂脂肪酸分析法本文件描述了从土壤中仅提取磷脂脂肪酸(PLFA)的简单方法。本文件适用于各种类型的土壤。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ISO18400-206土壤质量采样第206部分：实验室微生物过程、生物量和多样性评估用需氧条件下土壤的收集、处理和储存（Soilquality—Sampling—Part206:Collection,handlingandstorageofsoilunderaerobicconditionsfortheassessmentofmicrobiologicalprocesses,biomassanddiversityinthelaboratory）ISO11465土壤质量土壤干物质和水分含量的测定重量分析法（Soilquality—Determinationofdrymatterandwatercontentonamassbasis—Gravimetricmethod）GB/T33087仪器分析用高纯水规格及试验方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。BAME细菌酸甲酯（bacterialacidmethylester(s)）FA脂肪酸（fattyacid）EL-FA酯链脂肪酸（ester-linkedfattyacid）NEL-FA非酯链脂肪酸（non-ester-linkedfattyacid）FAME脂肪酸甲酯（fattyacidmethylester(s)）PL-FAME磷脂脂肪酸甲酯（phospholipidfattyacidmethylester(s)）ww土壤水分含量的质量分数，单位为每克干土中水的克数（g/gmassfractionofwaterinthesoil,ingramsofwaterpergramofdrysoil(g/g)）GC气相色谱（gaschromatography）HPLC高效液相色谱（high-performanceliquidchromatography）5原理采用Bligh-Dyer提取法提取脂质。通过柱层析法（硅胶固相萃取柱）将脂质提取物分离为中性脂质、糖脂和磷脂。磷脂通过温和的碱性水解反应转化为脂肪酸甲酯(FAME)。使用气相色谱法(GC)测定不同的FAME。上述流程的示意图见图1。2GB/ZXXXXX—XXXX6试验材料6.1土壤按照ISO18400-206的规定采集和制备土壤样本。按照ISO11465的方法测定土壤中水的质量分数ww。若样本在新鲜状态下过筛后未立即进行分析，可以储存在-20℃环境下或脂质提取后保存在氯仿中（见7.1）。6.2试剂除非另有说明，本文件所有试剂均为分析纯或指定的HPLC级，实验用水应符合GB/T33087高纯水的相关要求。6.2.1有机溶剂。6.2.1.1丙酮，C3H6O（HPLC级）。6.2.1.2氯仿，CHCl3（HPLC级）。6.2.1.3正己烷，C6H14（HPLC级）。6.2.1.4甲醇，CH3OH（HPLC级）。6.2.1.5甲苯，C7H8。6.2.2化学品3GB/ZXXXXX—XXXX6.2.2.12,6-二叔丁基对甲酚(BHT)，C15H24O。6.2.2.2柠檬酸，C6H8O7.H2O。6.2.2.3柠檬酸三钠，C6H5Na3O7.2H2O。6.2.2.4水合硅酸，SiO2.nH2O（若使用自制柱）。6.2.2.5无水硫酸钠，Na2SO4。6.2.2.6氢氧化钾，KOH。6.2.2.7醋酸，C2H4O2。6.2.2.8氢氧化钠，NaOH。6.2.2.9十九烷酸甲酯，C20H40O2。6.2.2.10氮气，N2，纯度≥99%。6.2.2.11氦气，He，纯度≥99.999%。6.2.3缓冲液和标准溶液。6.2.3.1氯仿/甲醇(CM)溶液，向1:2的氯仿和甲醇溶液中加入2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)6.2.3.2柠檬酸盐(CB)缓冲液，组分包括：——柠檬酸一水合物，0.15mol/L，称取15.76gC6H8O7.H2O溶于500mL水中；——柠檬酸三钠，0.15mol/L，称取22.06gC6H5Na3O7.2H2O溶于500mL水中；——为使pH值为4，向41mL柠檬酸三钠溶液中加入59mL柠檬酸溶液。6.2.3.3Bligh-Dyer(BD)溶液，向1:2:0.8的氯仿/甲醇/柠檬酸盐缓冲液中加入2,6-二叔丁基对甲示例（100mL氯仿：200mL甲醇：80mLCB）+BHT。6.2.3.4甲醇氢氧化钾溶液，0.2mol/L，0.56g氢氧化钾溶于50mL干燥甲醇（无水硫酸钠），现用现配。6.2.3.5提取溶液(SE)，4:1的正己烷和氯仿（体积分数）。6.2.3.6醋酸溶液，1mol/L，58ml/L。向750mL水中加入58mL醋酸，然后加水定容至1L。6.2.3.7氢氧化钠溶液，0.3mol/L，12g/L。称取12g氢氧化钠溶于750mL水中，然后加水定容至1L。6.2.3.8内标溶液(C19:0FAME)，100mg/L，1mL正己烷中含10mg十九烷酸甲酯的内标储备液用正己烷按1:100稀释。6.2.3.9标准溶液(BAME)，市售BAME标准溶液，用于定量分析。6.3设备常用的实验室设备和装置6.3.1聚四氟乙烯管或玻璃管，配聚四氟乙烯盖或带聚四氟乙烯隔膜的盖，约20mL。6.3.2巴斯德吸管。6.3.3烧瓶，容量为40mL，配带聚四氟乙烯隔膜的盖。6.3.4玻璃管，容量为20mL。4GB/ZXXXXX—XXXX6.3.5自制或市售硅胶柱，含500mg硅胶的固相萃取小柱。——聚丙烯管（1mL、5mL或10mL——无尘纤维。6.3.6通风橱。6.3.7超声波仪。6.3.8离心机。6.3.9冰箱。6.3.10柱温箱。6.3.11涡旋仪。6.3.12配有氮吹装置的水浴锅。6.3.13天平，精度1mg。6.3.14气相色谱仪，配有火焰离子化检测器或质谱仪（用于定性），石英毛细管柱（最短30m，内径0.25mm，膜厚0.25μm）；载气为氦气。7分析步骤7.1脂质提取（Bligh-Dyer提取）称取2g新鲜土壤(6.1)于20mL聚四氟乙烯管（或可替代物，6.3.1）中，加入11.9mLCM溶液（6.2.3.1），接着加入CB溶液（6.2.3.2），使含水量达3.16mL。CB溶液的体积按公式(1)计算。式中：VCB为CB溶液的体积，单位为毫升（mL）；ww为土壤水分含量的质量分数，单位为每克干土中水的克数。用涡旋仪(6.3.11)将样品混匀，在超声波仪（6.3.7）中超声30min后放入冰箱（6.3.94℃下静置过夜。涡旋样品，在离心机（6.3.8）中以1,300r/min离心10min，将上层清液移入40mL烧瓶（6.3.3）中。向含土壤悬浮液的试管（6.3.1）中加入5mLBD溶液（6.2.3.3再次涡旋所得混合物，并以1,300r/min离心处理10min。将上清液移入之前的40mL烧瓶（6.3.3）中，重复此程序两次。最后，向装有上清液的烧瓶中加入4mL氯仿（6.2.1.2）和4mLCB溶液（6.2.3.2）使其分层。将烧瓶放入冰箱（6.3.94℃下静置过夜。7.2使用硅胶柱分离脂质制备用于脂质分离的自制柱体前，需在100℃下活化0.5g的水合硅酸（6.2.2.4）1h。将无尘纤维放入10mL聚丙烯管（6.3.5用3mL氯仿（6.2.1.2）溶解活化过的水合硅酸并转移到管中，让氯仿挥发干。依次将2mL甲醇（6.2.1.4）、2mL丙酮（6.2.1.1）和2mL氯仿（6.2.1.2）加入自制或市售的柱体。注意避免吸附剂在溶剂淋洗过程中干透。5GB/ZXXXXX—XXXX将脂质提取物（7.1）用2×300µL氯仿溶出并加入柱体。依次向柱体加入5mL氯仿，12mL丙酮，并弃去所得的洗出物（分别含有中性脂质和糖脂）。加入8mL甲醇（加甲醇前准备好收集装置将洗出的磷脂提取物收集到干净的20mL带刻度试管（6.3.4）中。在30℃下用氮气吹干。得到的组分可在−20℃下储存3d，直至衍生化。7.3衍生-甲基化转移-净化将分离所得的样品（7.2）溶解于0.5mL干燥甲醇（6.2.1.4）和0.5mL干燥甲苯（6.2.1.5）中。加入1mL甲醇氢氧化钾溶液（6.2.3.4），以进行碱性甲醇分解。在涡旋仪中涡旋，并在37℃下保持至少30min。加入0.3mL醋酸(1M)（6.2.2.7）、5mLSE溶液（6.2.3.5）和3mL水，以停止反应。在超声波仪（6.3.7）中振摇30min，以1,300r/min离心5min，收集上层（有机相）。加入2mLSE溶液，再次提取下层（水相）（包括振摇和以1,300r/min离心5min的步骤），收集上层，合并两次上层有机相，弃去水层。向提取液中加入3mL氢氧化钠（6.2.3.7）溶液(12g/L)，以进行最后的洗涤。振摇30s，以1,300r/min离心15min。使用巴斯德吸管将上清液通过过滤器（例如，含无尘纤维和无水硫酸钠的聚丙烯管）转移到干净的带刻度瓶中。用3mLSE溶剂再次萃取水层，以1,300r/min离心5min，再通过过滤器将上清液转移到同一个瓶中。重复最后两个步骤（即添加SE溶剂和离心并将三次提取物收集在同一瓶中，在40℃下用氮气吹干。冷冻保存（-20℃)直到进行气相色谱分析（如果需要的话，保存一年）。7.4PLFA分析用50µL内标溶液（6.2.3.8）将提取物（7.3）溶解后待测。气相色谱（6.3.14）的参考条件为：进样量2µL；进样口温度200℃;载气为氦气（0.8mL/min柱温箱（6.3.10）在180℃下启动并保持1min，以2℃/min的速度升温至240℃,最后在240℃下保持1min。其它载气（氢气）、色谱柱和分析条件也能用来分离PLFA。通过与标准样品（6.2.3.9）的保留时间比较来识别脂肪酸。土壤提取物中各FAME的含量按公式(2)计算。式中：c——土壤中目标FAME的浓度，单位为纳摩尔每克（nmol/gRf,Ri——目标化合物和内标的平均响应；k——目标化合物相对于内标的校正因子，在响应方面