基因治疗学习资料

基因治疗分类体细胞(somaticcell)基因治疗生殖细胞(germline)基因治疗只限于某一体细胞的基因的改变只限于某个体的当代对缺陷的生殖细胞进行矫正当代及子代第二十三章基因治疗

基因治疗：指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。

狭义基因治疗：指目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内的基因发生整合、成为宿主基因组的一部分，目的基因表达产物起治疗疾病的作用。广义基因治疗：①外源正常基因导入病变细胞，产生正常基因的表达产物以补充缺失的或失去正常功能的蛋白质；②采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因；③将特定的基因导入非病变细胞，在体内表达特定产物；④向功能异常的细胞（肿瘤细胞）中导入该细胞中本来不存在的基因（如自杀基因），利用这些基因的表达产物达到治疗疾病的目的。基因治疗的概念

一、基因治疗的基本策略

二、基因治疗的基本程序

三、基因转移的方法

四、基因干预的方法第一节基因治疗的策略和基本程序

1、基因置换（genereplacement）

定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，导入的正常基因，以置换基因组内原有的缺陷基因。目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。

一、基因治疗的策略第一节基因治疗的策略和基本程序

定向整合的条件:转导基因的载体与基因组DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换。基因同源重组技术又称为基因打靶。细胞内基因同源重组的发生率很低。基因同源重组技术一、基因治疗的策略第一节基因治疗的策略和基本程序

1、基因置换（genereplacement）

定义:

通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。类型:在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。一、基因治疗的策略

2、基因增补（geneaugmentation）

第一节基因治疗的策略和基本程序

定义：采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。一、基因治疗的策略

3、基因干预（geneinterference）

第一节基因治疗的策略和基本程序

定义：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。应用：是恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。一、基因治疗的策略

4、自杀基因治疗（suicidegenetherapy）

第一节基因治疗的策略和基本程序

自杀基因的作用机制

第一节基因治疗的策略和基本程序

☻TK/GCV

单纯疱疹病毒（herpssimplexvirus,HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidine

kinase,tk）基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（ganciclovir,GCV）转变成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。（1）.自杀基因系统一、基因治疗的策略

4、自杀基因治疗（suicidegenetherapy）

第一节基因治疗的策略和基本程序

定义:“自杀基因”导入后，不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。

一、基因治疗的策略

4、自杀基因治疗（suicidegenetherapy）

（2）.旁观者效应（bystandereffect)第一节基因治疗的策略和基本程序

5、基因免疫治疗通过将抗癌免疫增强的细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。一、基因治疗的策略

4、自杀基因治疗（suicidegenetherapy）

3、基因干预（geneinterference）

2、基因添加（geneaugmentation）

1、基因置换（genereplacement）

第一节基因治疗的策略和基本程序

载体目的基因invivoexvivo靶细胞目录第一节基因治疗的策略和基本程序二、基因治疗的基本程序靶细胞在体外培养及进行基因修饰后再回输体内用于血液或免疫系统疾病如：骨髓细胞

体外方法第一节基因治疗的策略和基本程序

治疗靶细胞不宜体外获得、培养治疗基因直接注入患者体内需要有效的输入基因的方法治疗基因：裸基因或病毒运载基因体内方法第一节基因治疗的策略和基本程序

三、基因转移(genetransfer)技术

（一）.病毒介导的基因转移（二）.非病毒介导的基因转移一、基因治疗的策略第一节基因治疗的策略和基本程序

二、基因治疗的基本程序（一）.病毒介导的基因转移第一节基因治疗的策略和基本程序

三、基因转移(genetransfer)技术

1、反转录病毒载体

（一）.病毒介导的基因转移三、基因转移(genetransfer)技术

病毒感染宿主细胞释放RNA

ds-DNA

dsDNA整合到宿主基因组上mRNA病毒基因组合成病毒蛋白包装成新的病毒颗粒，出芽。RTaseHostRNApol.II转录（前病毒）（1）反转录病毒的生活周期

两端各有一长末端重复序列LTR。

LTR由U3、R和U5三部分组成。病毒有三个结构基因5ˊ端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列（ψ）及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)。

含有负链DNA转录的引物结合位点(PBS)和正链DNA转录的引物结合位点。在U3内有增强子和启动子；

U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS)

；

在R内还有poly(A)加尾信号。

gag基因，编码核心蛋白和属特异性抗原；pol基因，编码反转录酶；env基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。

（2）反转录病毒前病毒结构特点

LTRgagpolenvψLTR调节和启动转录产生病毒核心蛋白产生逆转录酶产生病毒外膜蛋白包装信号LTRgagpolenvψLTR包装信号

目的基因neo标记基因构建重组逆转录病毒载体

其基因组为缺陷型，保留了病毒的包装信号ψ，而缺失病毒的结构基因；不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒。

（3）反转录病毒载体

ψLTRLTRAmporiEr目的基因Neor辅助细胞株(如PA317)：由缺陷型反转录病毒感染构建而成。能合成结构蛋白，但本身却不能包装成完整的病毒颗粒。

（4）反转录病毒介导的基因转移系统

LTRgagpolenvLTRGag蛋白PoL蛋白Env蛋白Packingcell包装细胞（4）反转录病毒介导的基因转移系统

①高效地进入靶细胞。反转录病毒包膜上env编码的糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别。②缺失结构基因。gag、env和pol的不影响其他部分的活性。③高效整合到基因中。有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。④易于分离制备。包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组反转录病毒载体）以出芽的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中。

（5）反转录病毒载体的特点①随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；②反转录病毒载体的容量较小，只能容纳7kb以下的外源基因。（6）反转录病毒载体的缺点（5）反转录病毒载体的特点1、反转录病毒载体

2、腺病毒载体三、基因转移(genetransfer)技术

1、反转录病毒载体（一）.病毒介导的基因转移腺病毒是一种大分子(36kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。

2、腺病毒载体三、基因转移(genetransfer)技术

1、反转录病毒载体（一）.病毒介导的基因转移基因导入效率高，对人类安全；宿主范围广；基因转导与细胞分裂无关；重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；腺病毒载体容量较大，可插入7.5kb外源基因。目录三、基因转移(genetransfer)技术

（1）腺病毒载体的优点（一）.病毒介导的基因转移

2、腺病毒载体不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。可能产生复制型腺病毒。靶向性差。三、基因转移(genetransfer)技术

1.病毒介导的基因转移

（2）腺病毒载体的缺点

2、腺病毒载体三、基因转移(genetransfer)技术

1.病毒介导的基因转移（1）反转录病毒载体

（2）腺病毒载体（3）腺病毒相关病毒载体三、基因转移(genetransfer)技术

1.病毒介导的基因转移（1）反转录病毒载体

（2）腺病毒载体（3）腺病毒相关病毒载体一类单链线状DNA缺陷型病毒。可以高效定点整合至人19号染色体的特定区域19q13.4中，并能较稳定地存在。外源基因可以持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，兼具反转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。

常用基因治疗载体

整合致病性感染细胞克隆容量反转录病毒载体随机整合，效率高可能致病分裂细胞<7kb腺病毒载体不整合，可能丢失不致病分裂细胞、非分裂细胞

腺相关病毒载体定点整合(19号染色体特定区域)不致病分裂细胞、非分裂细胞<5kb<7.5kb三、基因转移(genetransfer)技术

1.病毒介导的基因转移三、基因转移(genetransfer)技术

1.病毒介导的基因转移（1）反转录病毒载体

（2）腺病毒载体（3）腺病毒相关病毒载体2.非病毒载体介导的基因转移系统（1）脂质体介导的基因转移技术（2）受体介导转移技术（3）基因直接注射技术三、基因转移(genetransfer)技术

一、基因治疗的策略第一节基因治疗的策略和基本程序

二、基因治疗的基本程序四、基因干预（geneinterference）

（一）反义RNA（antisenseRNA）（二）RNA干扰四、基因干预（geneinterference）

（一）反义RNA（antisenseRNA）作为基因药物，通过细胞内特异性mRNA互补，封闭特定基因的表达，达到治疗疾病的目的。（1）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。（2）构建一些能转录反义RNA的重组质粒，将这些质粒转入细胞中，转录出反义RNA而发挥作用。第一节基因治疗的策略和基本程序

四、基因干预（geneinterference）

（一）反义RNA（antisenseRNA）反义RNA的关键技术问题☻专一性转移问题☻反义RNA进入靶细胞前的降解问题受体介导反义RNA技转移术①受体介导的RNA转移十分专一，而且效率高；②被转移的RNA是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层,可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。第一节基因治疗的策略和基本程序

四、基因干预（geneinterference）

（二）RNA干扰1.RNA干扰现象RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制该基因的表达。其抑制基因表达的效率比反义RNA至少高2个数量级。第一节基因治疗的策略和基本程序

2.RNA干扰的机制RNA干扰过程主要有2个步骤：（1）小干扰性RNA（siRNA）（2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。该复合体可识别与siRNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断长双链RNA被细胞内的双链RNA特异性核酸酶Dicer切成21~23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA（smallinterferingRNA，siRNA）四、基因干预（geneinterference）

RNA干扰机制示意图研究基因功能的新工具

由于RNA