生化工程学：第7-8讲 色谱层析分离法

Chapter7

色谱层析分离法

Chromatography本章主要知识点什么是色谱分离技术？色谱分离技术的分类什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算？吸附色谱及其分类和基本原理什么是分配色谱？离子交换色谱的分类及应用凝胶色谱的分离原理及分类离子交换及疏水作用层析的原理高效液相色谱的分离原理及应用蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？色谱技术简介：色谱法又称色谱分析法、层析法，是一种制备、分离和分析方法。利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。

层析现象层析现象描述将一滴含有混合色素的溶液滴在一块布或一片纸上，随着溶液的展开可以观察到一个个同心圆环出现。色谱法的发展历史1901年俄国植物学家Tswett，发现这个石油醚从碳酸钙中分离植物色素的层析现象1903年提出了应用吸附原理分离植物色素的新方法，1906年将这种方法命名为色谱法(Chromatography)，色谱法(Chromatography)是由颜色(chrom)和图谱(graph)这两个词根组成

1931年德国库恩Kuhn将茨维特的方法应用于叶红素和叶黄素的研究，库恩的研究获得了广泛的承认，也让科学界接受了色谱法，色谱法的发展历史1938年英国科学家马丁（Martin）和辛格（Synge）准备利用氨基酸在水和有机溶剂中的溶解度差异分离不同种类的氨基酸，失败。方案更新1941年，Martin和Synge采用水分饱和的硅胶为固定相，以含有乙醇的氯仿为流动相分离乙酰基氨基酸，成功。（分配色谱产生）1943年马丁以及辛格又发明了在蒸汽饱和环境下进行的纸色谱法。1952年的诺贝尔化学奖色谱法的发展历史1951年Martin和James报道了用自动滴定仪作检测器分析脂肪酸，创立了气-液色谱法；1958年Golay首先提出了分离效能极高的毛细管柱气相色谱法，发明了玻璃毛细管拉制机，从此气相色谱法超过最先发明的液相色谱法而迅速发展起来，

1960年代末科克兰、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。色谱经典实验在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物色素（植物叶的提取液）的石油醚倒入管中。此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。然后用纯石油醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不断地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素，并可分别进行鉴定。

色谱技术

概念

利用混合物中各组分的物理化学性质(分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等)的不同，使各组分以不同程度分布在固定相（多孔介质）和流动相中，当流动相流过固定相时，根据物质在两相间的分配行为不同，各组分以不同的速度移动，经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），而达到分离的技术。色谱分离方法的分类1、按两相所处的状态分类

气相色谱法：

气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC）根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱（GSC）和气液色谱（GLC）。

相色谱法：液体为流动相的色谱称液相色谱（LC）液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC）。超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色谱（SFC）。通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（CBPC）.高效液相色谱（HPLC）稠环芳烃的分析稠环芳烃多为致癌物质。固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水～100%甲醇；线性梯度淋洗，2%/min流速：1ml/min柱温：50℃柱压：70×104Pa检测器：紫外检测器高效液相色谱法分离组分(HPLC)

高效液相色谱（HPLC）/液质联用（LC-MS）/核磁

（NMR）在药物检测中的应用HPLCLC/MSNMR色谱分离方法的分类2、按固定相的几何形式分类1.柱色谱法(columnchromatography)柱色谱法是将固定相装在一金属或玻璃柱中或是将固定相附着在毛细管内壁上做成色谱柱，试样从柱头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的色谱法。2.纸色谱法（paperchromatography）

纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体，把试样点在滤纸上，然后用溶剂展开，各组分在滤纸的不同位置以斑点形式显现，根据滤纸上斑点位置及大小进行定性和定量分析。3.薄层色谱法(thin-layerchromatography,TLC)

薄层色谱法是将适当粒度的吸附剂作为固定相涂布在平板上形成薄层，然后用与纸色谱法类似的方法操作以达到分离目的。

纸色谱法纸层析是一种常用的快速分离、鉴定方法，可用于定性分析以及确定分离方案，但一般不用于定量分析介质：滤纸操作方法：将试样溶于适当溶剂中，点样于滤纸的一端；选用适当的展开剂，借助毛细管现象从点样的一端向另一端流动，展开结束后，取下滤纸，晾干，染色显迹薄层色谱仪

薄层色谱法将固定相涂布在惰性固体上，形成薄层进行色谱分离的方法常用的固定相有：硅胶和氧化铝优点：设备简单、操作方便快速显色方式多，如可以选用浓硫酸等进行显色灵敏度高（较纸层析）可以大量制备常用的吸附剂：氧化铝、硅胶、活性炭纤维素、聚酰胺、硅藻土展开剂的选择展开剂可以是单一溶剂，也可以是混合溶剂常用的氨基酸纸层析体系中使用的展开剂为：正丁醇-甲酸-水（15：3：2）展开方式：上行色谱；下行色谱；径向色谱展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果展开剂选择的原则：（1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小（2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力色谱分离方法的分类3、按分离原理分类

1.吸附色谱法(adsorptionchromatography)

利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。

2.分配色谱法(partitionchromatography)

利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。3.离子交换色谱法

利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，即离子交换色谱法。

4.尺寸排阻色谱法

利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。

5.亲和色谱法

利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分离。色谱分离过程（1）加样，混合物进入填充柱。（2）展开，用移动相将通过固定相的渗滤液带出，各组分随流经的距离或时间分开。（3）分部收集，把流出的液体按照一定的记数方式分次收集。或从薄层中刮下。色谱分离方法的分类1。洗脱法也称冲洗法（1）将样品加到色谱柱头上，（2）用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同.被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使各组分分层且分离完全，层与层之间隔着一层溶剂。色谱分离方法的分类顶替法（1）将样品加到色谱柱头，（2）在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动相），（3）通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相。

处理量较大，且各组分分层清楚，但层与层相互连接，不能将组分完全分离。

2）顶替法（displacementdevelopment）混合样加样顶替剂分离结果

将混合物样品加到分离柱后，然后用亲和力大的顶替剂流过分离柱，试样中的各组分按亲和力由小到大顺序依次被顶替出分离柱。

3）迎头法（frontalmethod）

样品液分离柱

让待分离的混合物连续地通过分离柱，开始各组分被留在柱上，待饱和后就流出分离柱。开始出现的是亲和力最小的，各得到一部分纯物质。然后各组分依亲和力逐步增加的顺序出现，最终各组分的浓度与样品中相同。迎头法可用于那些分离场合？色谱系统的基本组成色谱分离的参数分配系数（Kd)：溶质在固定相中的浓度q与移动相中的浓度c之比。可由Langmuir方程得出Kd分配系数q、c溶质在固相和液相中的浓度保留时间（tR）和保留体积（VR）反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一色谱分离的基本概念阻滞因子Rf在色谱系统中溶质的迁移速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相Kd=0）的迁移速度之比。Rf=tm/ts+tm

(marker，solut)其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小色谱固相的阻滞作用产生的机理：相的变化溶质从液相传递到固相相的分配-在不同液相中的分配差异溶液中的分子筛效应电场作用等色谱分离的基本概念洗脱体积(或溶出体积Ve）色谱柱中，溶质的最大浓度区从柱中流出时已流出的流动相的体积，或者使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异。色谱分离的基本概念色谱柱的理论塔板数、塔板高度反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系理论塔板数的计算方法：N理论塔板数tR保留时间W1/2半峰宽Wb峰底宽度理论塔板高度：L柱长1、吸附色谱Adsorptionchromatography原理:利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离关键要素：吸附剂和展开剂的选择吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如-OH和-NH2吸附色谱

吸附柱层析

将吸附剂填装在玻璃或不锈钢管中，构成层析柱，层析时欲分离的样品自柱顶加入，当样品溶液全部流入吸附层析柱后，再加入溶剂冲洗。冲洗的过程称为洗脱，加入的溶剂称为洗脱剂。一般吸附色谱的操作程序（1）根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相（2）吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pH值、流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数（3）洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pH值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物理想的洗脱曲线

A峰和B峰均呈对称形，二者没有重叠，这表明样品液中的组分已完全分开。层析峰的面积(FEG)、峰高(BE)和半峰高宽度(HI)等参数是定性、定量洗脱物的依据。2、分配色谱（分配层析）原理：利用溶质各组分在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法要素：固定相、载体、流动相典型类型：纸层析分配系数(K)指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比值：

K=固定相中溶质的浓度/流动相中溶质的浓度载体：通常为惰性材料，能吸附液体固定相载体种类：硅胶硅藻土纤维素葡聚糖凝胶分配色谱（分配层析）固定相：通常选取各组分溶解度大的溶剂作为固定相流动相可以是极性的（反相色谱法SiO2），也可以是非极性的（正相色谱）*反相色谱固定相是非极性的,流动相是极性的反相液相色谱反相液相色谱分离多肽和蛋白质使基于蛋白质的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度地满足疏水的要求通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）来增大蛋白质和多肽的疏水性载体：微粒多孔硅胶（粒径5μm~20μm）HypersilSpherosilXOB075固定相：C18、C8烷基链，C8适于分离蛋白质C18适于分离核酸，苯基。流动相的选择通常采用有机溶剂，甲醇、乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃30µm15µm5µmInfluenceofParticleSizeontheSeparationeffectSourceRPC3.离子交换色谱以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法。在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换色谱基本原理

离子交换剂是由基质、电荷基团(或功能基团)和反离子构成的，基质与电荷基团以共价键连接，电荷基团与反离子以离子键结合。离子交换剂与分离液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，假设以RA+代表阳离子交换剂，其中A+为反离子，A+能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应，反应式为：RA++B+RB++A+氨基酸的离子交换分离原理X＋X＋X＋X＋X＋X＋Y＋X＋Z＋X＋Y＋Z＋Z＋Y＋Y＋Y＋X＋Z＋X＋Z＋X＋Z＋Z＋X＋X＋X＋Y＋Z＋Y＋Z＋Ｘ＋Ｘ＋X＋X＋X＋X＋Ｚ＋X＋Ｚ＋X＋X＋OH－nX＋平衡上样吸附洗杂洗脱离子交换法离子交换色谱离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，这种结合力的大小是由离子交换剂的选择性决定的。强酸性(阳性)离子交换剂对H+的结合力比对Na+的小；强碱性(阴性)离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-的小得多；弱酸性离子交换剂对H+的结合力远比对Na+的大；弱碱性离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-的大。离子交换色谱离子交换剂应满足的基本条件有：

①有高度的不溶性。即在各种溶剂中不发生溶解；②有疏松的多孔结构或巨大的表面积，使交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换；③有较多的交换基团；④有稳定的物理化学性质。在使用过程中，不因物理或化学因子的变化而发生分解和变形等现象。

决定吸附容量的重要因子采用何种反离子进行电荷平衡离子交换剂与各种水合离子(离子在水溶液中发生水化作用形成的)的结合力与离子的电荷量成正比，而与水合离子半径的平方成反比。所以，离子价数越高，结合力越大。在离子间电荷相同时，则离子的原子序数越高，水合离子半径越小，结合力亦越大。离子交换色谱两性离子（如蛋白质、和核苷酸等）与离子交换剂的结合力主要取决于它们的物理化学性质和在特定pH条件下呈现的离子状态。当pH低于等电点(pI)时，它们带正电荷能与阳离子交换剂结合；pH高于pI时，它们带负电荷能与阴离子交换剂结合。pH与pI的差值越大，带电量越大，与交换剂的结合力越强。

离子交换层析本质

主要依据是离子交换剂对各种离子或离子化合物有不同的结合力。离子交换剂的种类

根据离子交换剂中基质的组成和性质，可将其分成两大类：

1.疏水性离子交换剂

疏水性离子交换剂中的基质是人工合成的与水结合力较小的树脂。常用树脂由苯乙烯和二乙烯苯合成的聚合物，其中二乙烯苯是交联剂，能把聚乙烯苯直链化合物连接成类似海绵状的结构，在此结构中以共价键引入不同的电荷基团。离子交换树脂以电荷基团的性质分则有：阳离子交换树脂、阴离子交换树脂(分别包括强、中、弱三种电荷基团)螯合离子交换树脂(对金属离子有较强的选择性)。阳离子交换剂

(1)阳离子交换剂的电荷基团带负电，反离子带正电。因此，可以与溶液中的正电荷化合物或阳离子进行交换反应。根据电荷基团的强弱，又可将阳离子交换剂分为强酸型(带磺酸基团)、中强酸型(带磷酸基团或亚磷酸基团)和弱酸型(带羧基的或酚基)三种。常用的离子交换树脂葡聚糖凝胶型

DEAE-SephadexA-25，QAE-SephadexA-25，CM-SephadexC-25，SP-SephadexC-25纤维素系列离子交换剂

DEAE-SephacelCellex系列琼脂糖系列离子交换剂

Sepharose系列SepharoseCL-6B,SepharoseFastFlowBio-GelA系列交联琼脂糖离子交换剂MiniQPC3.2/3:GlutathionesynthetaseSDSStartingmaterialPeak2ExpandedBed

影响交换作用的因素：树脂颗粒的大小、树脂内部空隙大小，扩散速率，树脂容量，反应基团种类，树脂寿命。例子：链霉素的回收。

关于色谱柱的再生阴离子交换剂

(2)阴离子交换剂是在树脂中分别引入季胺〔-N(CH3)3〕、叔胺〔-N(CH3)2〕、仲胺〔-NHCH3〕和伯胺〔-NH2〕基团构成的。当引入季胺和叔胺基团时，分别为强阴性和中强阴性离子交换剂。当引入仲胺和伯胺基团时，为弱阴性离子交换剂。4.凝胶过滤色层分离法凝胶层析，又称为凝胶过滤、分子排阻层析或分子筛层析。是以各种凝胶为固定相，利用流动相中所含各物质的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。分子筛和排阻的效应！凝胶过滤色层分离法基本原理当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。适用水溶性高分子物质。优点 操作简便 分离效果好，重复性高，回收率高 分离条件温和 应用广泛适用于生物大分子的初级分离，脱盐 分辨率低分子筛凝胶色谱原理凝胶过滤色层分离法样品中各组分的流出顺序，可用分配系统Ka来量度：

Ka=(Ve-Vo)/Vi

式中Ve：为洗脱体积(elutionvolume)，表示某一组分从层析柱洗出到最高峰出现时，所需的洗脱液体积；

Vo：外体积(outervolume)，为层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积；

Vi：内体积(innervolume)，为层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积。凝胶过滤色层分离法当某组分的Ka=0时(即Ve=Vo)，说明该组分完全不进入凝胶颗粒微孔，洗脱时最先流出；

若某组分的Ka=1(即Ve=Vo+Vi)时，说明该组分可自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，洗脱时，最后流出；

Ka在0-1之间的组分，洗脱时Ka值小的先流出，Ka值大的后流出。凝胶过滤色层分离法Vo=Vt-Vi-Vg

式中Vg：凝胶基质本身的体积；Vi：内体积；Vt：层析柱内凝胶床的总体积。

Vt可通过测量柱内径和凝胶床高度计算出来，即

Vt=（1/4）πR2h

洗脱体积Ve可通过加进某一组分后实际测量而得，也可以在已知Ka后计算出来。即

Ve=Vo+KaVi凝胶过滤色层分离法一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用。当洗脱液的体积等于Vo+Vi时，所有组分都应该被洗脱出来，即Ka的最大值为1。某种情况下Ka值会大于1。说明这一层析过程不是单纯的凝胶层析，其中可能还夹杂有吸附或离子交换等过程。凝胶过滤色层分离法同一类型的化合物而言，组分的洗脱体积Ve与相对分子质量(Mr)的关系可用下式表示：

Ve=K1-K2lgMr式中K1，K2为常数。凝胶色谱填料葡聚糖凝胶SephadexG-系列聚丙烯酰胺凝胶 Sephacryl系列琼脂糖凝胶Sepharose系列Superose系列聚苯乙烯凝胶的共同特点内部具有微细的多孔网状结构，其孔径的大小与被分离物质的相对分子质量大小有相应的关系。凝胶的选择(1)聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶，由丙烯酰胺(CH3=CH-CONH2)与甲叉双丙烯酰胺(CH3=CH-CONH-CH2-NHCO-CH=CH2)共聚而成。商品名称为生物胶P(Bio-Ge1P)。聚丙烯酰胺凝胶优点：完全惰性的，适宜于各种蛋白质、核苷及核苷酸等的分离纯化。缺点：遇强酸时酰胺键会水解，一般在pH2-11的范围内使用。凝胶的选择(2)葡聚糖凝胶（Glucosan）由相对分子质量为4╳104-20╳104的葡聚糖交联聚合而成。葡聚糖凝胶优点：由Pharmacia(GE)公司生产的商品Sephadex的，具有良好的化学稳定性等，为最常用的凝胶之一。Sephadex耐碱，在0.01mol/L盐酸中放置半年不受影响，故广泛用于各种物质的分离纯化。凝胶的选择Sephadex的型号:G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200等多种型号、区别:G后面的数字越大，胶粒内的孔经越大，越适合于大分子的分离，但颗粒的机械强度随孔经的增大而降低，较高的操作压会使G75、G100、G150、G200等颗粒变形而使洗脱液的流速下降，使用技巧:故用上述型号的Sephadex进行层析时，流速慢，时间长。同型号的Sephadex，颗粒越细，在同样柱长的柱子中分辨力越好，但流速也越慢。(3)琼脂糖凝胶从琼脂中除去带电荷的琼脂胶导致不带电荷，用琼脂糖制成颗粒内孔径不等的多种型号层析用琼脂糖凝胶，商品为Sepharose。Sepharose的优点与缺点孔经大，机械强度好，层析时流速较快，但只能分离相对分子质量较大的分子。凝胶的选择

琼脂糖凝胶商品

Pharmacia(GE)公司推出商品名为Supersose，主要有含琼脂糖6%的Superose6和含琼脂脂糖12%的Superose12及其衍生物。

Superose特点刚性特好，理化稳定性高，在高黏度液体(如8mol/L尿素)下能保持较好的流速，适合于糖类、核酸、病毒和包含体蛋白在促溶剂中的纯化。Desaltingproteinsproteinssalts5.亲和色谱（特异配基层析法Affinitychromatography）亲和层析简介

利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。物理或化学的过程。常用专一而又可逆的亲和力的生物分子具有是成对互配的主要的有：酶和底物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体、DNA与结合蛋白等。

注意在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液中的另一方分子进行亲和层析，达到分离纯化目的。亲和层析的示意图亲和色谱（Affinitychromatography）载体活化、配基固相化、亲和、解离亲和色谱（Affinitychromatography）配基与偶联凝胶的选择与处理

在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基(ligand)。配基必须偶联于不溶性母体(matrix)(又称载体或担体)上，常用的载体主要有：琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素等。亲和色谱（Affinitychromatography）当用小分子作为配基时，由于空间位阻不易与载体偶联，或不易与配对分子载体结合。为此通常在载体和配基之间接入不同长度的连接臂(spacearm)。偶联时，必须首先使载体活化。即通过某种方法(如溴化氰法、叠氮法等)为载体引入某一活泼的基团。亲和色谱（Affinitychromatography）活化载体(包括带连接臂的)常用的有：

(1)溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B(CNBr-activatedsepharose4B)：通过自发反应可安全、简便、快速地与含有伯胺基的配基偶联。

(2)氨基琼脂糖凝胶4B(AH-sepharose4B)：含有六碳(C6)长度的连接臂，可与含有羧基的配基偶联。

(3)羧基琼脂糖凝胶4B(CH-sepharose4B)：含有六碳(C6)长度的连接臂，可与含有氨基的配基偶联。亲和色谱（Affinitychromatography）(4)活化的羧基琼脂糖凝胶4B(ActivatedCH-sepharose4B)：含有六碳连接臂和一个活化的酯化基团，可自发地与含有氨基的配基偶联

(5)环氧活化的琼脂糖凝胶6B(Epoxy-activatedsepharose6B)：含有一条长的亲水连接臂，可与含有羟基、氨基或巯基的配基偶联。

(6)活化的巯基琼脂糖凝胶4B(ActivatedThiolsepharose4B)：含有一分子谷胱甘肽作为连接臂，可与含有游离巯基的蛋白质配基可逆偶联。

(7)巯丙基琼糖凝胶6B(Thiopropylsepharose6B)：含有一个较短的亲水连接臂(2-巯丙基)，可与含有巯基的蛋白质或其他小分子配基可逆偶联，也可以与重金属离子、烷基和芳香基反应，并且进一步与含有：C＝，—C=C—，—N=N—键的化合物反应。亲和色谱（Affinitychromatography）亲和层析预处理（1）根据目的物质的特性，选择与之配对的分子作为配基，（2