实验动物 呼肠孤病毒Ⅲ型检验方法 编制说明

《实验动物呼肠孤病毒Ⅲ型检测方法》GB14926.25修订编制说明根据国家标准委员会2023年国家标准复审修订计划（国标委发[2023]642025年2月，标准编制组在北京召开线下会议，就标准的编制格式做了统一部依据工作分工，广东省生物技术研究院（广小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠必须排除的病原项目。1994年，国家质量技术监督局发布实施实验动物质量标准准GB14922，第一次以技术标准的形式提出实验动的提高起到了非常重要的作用。实验动物国家标准呼肠孤病毒Ⅲ型检测方法做确认试验。ELISA抗体检测因方法稳定、高通量、高敏感性而且商品化试剂较成熟，易于操作，仍然是我国实验动物呼肠欧盟许多实验动物质量检测实验室都推荐采用抗体检测结合核酸检测作为设施质量控制的完整技术体系。国内一些实验动物检测机构也开展了实验动物病原量检测之外，还可以应用于实验动物产品、实验动物接种物和污染环境评价等，孤病毒Ⅲ型核酸检测方法研究。所建立的Reo3核酸检测方法与小鼠肝炎病毒1.科学性原则。在尊重科学、亲身实践、调查研究的基础上2.可操作性原则。本标准无论是从样品采集，处理，RNA抽提，PCR反应，均c.新增核酸检测方法，包括核酸检测原理（见第3六、主要试验或验证的分析、综述报告，技度（0.05~0.5µM）进行优化，以反应的前3-15个循环的荧光信号为荧光本底信来判断优化结果；采用二温循环法对反应的退火温度表2Reo3实时荧光RT-PCR特异性试验编号样本平均Ct特异性样本N-1阴性样本NotN-2阴性样本NotN-3阴性样本NotN-4BHK细胞对照NotN-5仙台病毒NotN-6小鼠肝炎（MHV）NotN-7小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）NotN-8小鼠肺炎病毒（PVM）NotN-9小鼠诺如病毒（MNV）NotN-10小鼠出血热病毒（HV）NotN-11淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）NotP1呼肠孤病毒（Reo3）24图1Reo3实时荧光RT-PCR特异性试验6.4敏感性试验将Reo3RNA标准品Easydilution（Takara公司）做10倍系列稀释，得到结果可见各梯度之间间隔的Ct值基本相等，无模板对照（Notemplatecontrol，2标准品在1×109copies/μL~1×102copies/图2Reo3实时荧光RT-PCR敏感性检测结果1-8依次为1×109copies/μL至1×102copies/μL标准品，9、10为NTC和无模板对照。表3标准曲线对应Ct值样品名称拷贝数标准品19标准品28标准品37标准品46标准品55标准品64标准品7标准品800只进行人工感染小鼠Reo3试验，感染后（0-129d）不同时间段采集样本进行抗接种后18d抗体阳性，之后抗体效价逐渐升高，在25d抗体稀释度达到128表4染小鼠抗Reo-3血清抗体的测定047 ±±±±±±±±±±±抗体滴度为能检出阳性结果的最大稀释倍数log2数值。、感染靶器官病毒含量的测定（图3）感染早期小鼠以肝(Liver)病毒载量最高,其次是心(Heart)、脾(Spleen)、图3感染小鼠各内脏组织核酸测定（n=1~3）表5抗体检测与核酸检测规律图样本采集时间00/160/1640/38/168/163/3256/6355/56/163/16729/90/243/33/24应同时设置阳性对照和阴性对照。对2012-2015年送检的96份SPF级小鼠盲肠内容物进行检测，结果检出0份阳性，阳性率为0。6.6第三方实验室验证依据广东省生物技术研究院（原广东省实验动物监测所，简称广东生研6.5.2验证单位：中国医学科学院医学实验动物研究所、苏州西山生物技术有限6.5.3验证方法：由广东生研院负责样品的制备、验证及发样，验证单位采用各广东省实验动物监测所采用实验动物团体标准所述Reo-3PCR检测方法与3测，检测结果均与被检项目结果一致。说明所建立的ReoReo3核酸检测实验室间比对结果序号比对样本编号验证单位检测方法结果符合性1T20170703-F1中国医学科学院医学实验动物研究所RT-PCR一致2T201