青霉素工艺流程

青霉素生产工艺班级:生工（2）姓名:学号:080040【摘要】:青霉素是指分子中含有青霉烷,能破坏细菌细胞壁并在细菌细胞繁殖期起杀菌作用一类抗生素。青霉素对溶血性链球菌等链球菌属,肺炎链球菌和不产青霉素酶葡萄球菌含有良好抗菌作用。对肠球菌有中等度抗菌作用,淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、白喉棒状杆菌、炭疽芽孢杆菌、牛型放线菌、念珠状链杆菌、李斯特菌、钩端螺旋体和梅毒螺旋体对本品敏感。本品对流感嗜血杆菌和百日咳鲍特氏菌亦具一定抗菌活性,其她革兰阴性需氧或兼性厌氧菌对本品敏感性差.本品对梭状芽孢杆菌属、消化链球菌厌氧菌以及产黑色素拟杆菌等具良好抗菌作用,对脆弱拟杆菌抗菌作用差。青霉素经过抑制细菌细胞壁四肽则链和五肽交连桥结合而阻碍细胞壁合成而发挥杀菌作用。对革兰阳性菌有效,因为革兰阴性菌缺乏五肽交连桥而青霉素对其作用不大。【关键词】:青霉素;生产工艺【正文】:抗生素工业生产包含发酵和提取两部分。工艺步骤大致以下:菌种保藏、孢子制备、种子制备、发酵、提取和精制。种子和发酵培养基常见碳源有:葡萄糖、淀粉、蔗糖、油脂、有机酸等,关键为菌体生长代谢提供能源,为合成菌体细胞和目产物提供碳元素。有机氮源多用玉米浆、黄豆饼粉、麸质粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉等,硫酸铵、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸铵则是常见无机氮源。另外,培养基中还得添加无机盐、微量元素以及消沫剂,部分抗生素还得加入特殊前体,如青霉素前体是苯乙酸,大环内酯类抗生素前体是丙酸盐。发酵过程普遍补加一个碳源、氮源物质,如葡萄糖和硫酸铵。pH值经过流加氨水进行调整,很多抗生素在发酵中后期流加前体,对提升产量非常有益。抗生素发酵绝大多数为好氧培养,必需连续通入大量无菌空气,全过程大功率搅拌。发酵液预处理,通常加絮凝剂沉淀蛋白,过滤去除菌丝体,发酵滤液提取常见溶媒萃取法、离子交换树脂法、沉淀法、吸附法等提纯浓缩,然后结晶干燥得纯品。一、青霉素概述青霉素是抗菌素一个,是指从青霉菌培养液中提制分子中含有青霉烷、能破坏细菌细胞壁并在细菌细胞繁殖期起杀菌作用一类抗生素,是第一个能够诊疗人类疾病抗生素。青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素总称。但它不能耐受耐药菌株(如耐药金葡)所产生酶,易被其破坏,且其抗菌谱较窄,关键对革兰氏阳性菌有效。最初青霉素生产菌是音符型青霉菌,生产能力只有几十个单位,不能满足工业需要。随即找到了适合于深层培养橄榄型青霉菌,即产黄青霉。二、发酵条件下生长过程第1期:分生孢子萌发,形成芽管,原生质未分化,含有小泡。

第2期:菌丝繁殖,原生质体含有嗜碱性,类脂肪小颗粒。

第3期:形成脂肪包涵体,机理贮藏物,没有空泡,嗜碱性很强。

第4期:脂肪包涵体形成小滴并降低,中小空泡,原生质体嗜碱性减弱,开始产生抗生素。

第5期:形成大空泡,有中性染色大颗粒,菌丝呈桶状,脂肪包涵体消失,青霉素产量最高。

第6期:出现部分自溶细胞,细胞内无颗粒,仍然桶状。释放游离氨,pH上升。

第7期:菌丝完全自溶,仅有空细胞壁。

镜检:要求时间取样,显微镜观察7个时期形态改变,控制发酵。

1－4期为菌丝生长久,3期菌体适宜为种子。

4－5期为生产期,生产能力最强,经过工程方法,延长此期,取得高产。

在第六期到来之前结束发酵。

三、青霉素发酵工艺过程青霉素生产步骤:

1、发酵工艺过程

（1）生产孢子制备将砂土保藏孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成培养基进行斜面培养,经传代活化。最适生长温度在25~26℃,培养6~8天,得单菌落,再传斜面,培养7天,得斜面孢子。

移植到优质小米或大米固体培养基上,生长7天,25℃,制得小米孢子。

每批孢子必需进行严格摇瓶试验,测定效价及杂菌情况。

（2）种子罐和发酵罐培养工艺种子培养要求产生大量健壮菌丝体,所以,培养基应加入比较丰富易利用碳源和有机氮源。青霉素采取三级发酵

一级种子发酵:发芽罐.小罐,接入小米孢子后,孢子萌发,形成菌丝。培养基成份:葡萄糖,蔗糖,乳糖,玉米浆,碳酸钙,玉米油,消沫剂等。通无菌空气,空气流量1:3（体积比）;充足搅拌300－350r/min;40~50小时;pH自然,温度27±1℃。

二级发酵罐:繁殖罐.大量繁殖。玉米浆、葡萄糖等。1:1－1.5;250－280r/min;pH自然,25±1℃;0－14h。

三级发酵罐:生产罐。花生饼粉（高温）,麸质粉、玉米浆、葡萄糖,尿素,硫酸铵,硫酸钠、硫代硫酸钠,磷酸二氢钠,苯乙酰胺及消泡剂,CaCO3等。接种量为12-15%。青霉素发酵对溶氧要求极高,通气量偏大,通气比控制0.7-1.8;150－200r/min;要求高功率搅拌,100m3发酵罐搅拌功率在200-300Kw,罐压控制0.04-0.05MPa,于25-26℃下培养,发酵周期在200h左右。前60h,pH5.7-6.3,后6.3-6.6;前60h为26℃,以后24℃。

四、发酵过程控制在青霉素生产中,让培养基中关键营养物只够维持青霉菌在前40h生长,而在40h后,靠低速连续补加葡萄糖和氮源等,使菌半饥饿,延长青霉素合成期,大大提升了产量。所需营养物限量补加常见来控制营养缺点型突变菌种,使代谢产物积累到最大。

（1）培养基青霉素发酵中采取补料分批操作法,对葡萄糖、铵、苯乙酸进行缓慢流加,维持一定最适浓度。葡萄糖流加,波动范围较窄,浓度过低使抗生素合成速度减慢或停止,过高则造成呼吸活性下降,甚至引发自溶,葡萄糖浓度调整是依据pH,溶氧或CO2释放率给予调整。碳源选择:生产菌能利用多个碳源,乳糖,蔗糖,葡萄糖,阿拉伯糖,甘露糖,淀粉和天然油脂。经济核实问题,生产成本中碳源占12％以上,对工艺影响很大;糖与6-APA结合形成糖基-6-APA,影响青霉素产量。葡萄糖、乳糖结合能力强,而且随时间延长而增加。通常采取葡萄糖和乳糖。发酵早期,利用快效葡萄糖进行菌丝生长。当葡萄糖耗竭后,利用缓效乳糖,使pH稳定,分泌青霉素。可依据形态改变,滴加葡萄糖,替换乳糖。现在普遍采取淀粉酶水解产物,葡萄糖化液流加。降低成本。

氮源:玉米浆是最好,是玉米淀粉生产时副产品,含有多个氨基酸及其前体苯乙酸和衍生物。玉米浆质量不稳定,可用花生饼粉或棉籽饼粉替换。补加无机氮源。

无机盐:硫、磷、镁、钾等。铁有毒,控制在30µg/ml以下。

流加控制:补糖,依据残糖、pH、尾气中CO2和O2含量。残糖在0.6％左右,pH开始升高时加糖。补氮:流加酸酸铵、氨水、尿素,控制氨基氮0.05%。

添加前体:合成阶段,苯乙酸及其衍生物,苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可为青霉素侧链前体,直接掺入青霉素分子中。也含有刺激青霉素合成作用。但浓度大于0.19％时对细胞和合成有毒性。还能被细胞氧化。策略是流加低浓度前体,一次加入量低于0.1%,保持供给速率略大于生物合成需要。

（2）温度一生长适宜温度30℃,分泌青霉素温度20℃。但20℃青霉素破坏少,周期很长。生产中采取变温控制,不一样阶段不一样温度。前期控制25－26℃左右,后期降温控制23℃。过高则会降低发酵产率,增加葡萄糖维持消耗,降低葡萄糖至青霉素转化得率。有发酵过程在菌丝生长阶段采取较高温度,以缩短生长时间,生产阶段合适降低温度,以利于青霉素合成。

（3）pH合成适宜pH6.4－6.6左右,避免超出7.0,青霉素在碱性条件下不稳定,易水解。缓冲能力弱培养基,pH降低,意味着加糖率过高造成酸性中间产物积累。（4）溶氧溶氧＜30％饱和度,产率急剧下降,低于10％,则造成不可逆损害。所以不能低于30％饱和溶氧浓度。通气比通常为1:0.8VVM。溶氧过高,菌丝生长不良或加糖率过低,呼吸强度下降,影响生产能力发挥。适宜搅拌速度,确保气液混合,提升溶氧,依据各阶段生长和耗氧量不一样,对搅拌转速调整。（5）菌丝生长速度与形态、浓度对于每个有固定通气和搅拌条件发酵罐内进行特定好氧过程,都有一个使氧传输速率（OTR）和氧消耗率（OUR）在某一溶氧水平上达成平衡临界菌丝浓,超出此浓度,OUR＞OTR,溶氧水平下降,发酵产率下降。在发酵稳定时,湿菌浓可达15~20%,丝状菌干重约3%,球状菌干重在5%左右。另外,因补入物料较多,在发酵中后期通常天天带放一次,每次放掉总发酵液10%左右。有丝状生长和球状生长两种。前者因为全部菌丝体都能充足和发酵液中基质及氧接触,比生产率高,发酵粘度低,气/液两相中氧传输率提升,许可更多菌丝生长。球状菌丝形态控制,与碳、氮源流加情况,搅拌剪切强度及稀释度相关。

（6）消沫发酵过程泡沫较多,需补入消沫剂。天然油脂:玉米油;化学消沫剂:泡敌。少许数次。不适在前期多加入,影响呼吸代谢。青霉素发酵过程控制十分精细,通常2h取样一次,测定发酵液pH、菌浓、残糖、残氮、苯乙酸浓度、青霉素效价等指标,同时取样做无菌检验,发觉染菌立刻结束发酵,视情况放过滤提取,因为染菌后pH值波动大,青霉素在多个小时内就会被全部破坏。五、青霉素提炼工艺过程青霉素提纯工艺步骤简图:

青霉素不稳定,发酵液预处理、提取和精制过程要条件温和、快速,预防降解。

1.预处理发酵液结束后,目标产物存在于发酵液中,而且浓度较低,如抗生素只有10－30Kg/m3,含有大量杂质,它们影响后续工艺有效提取,所以必需对其进行预处理,目在于浓缩目产物,去除大部分杂质,改变发酵液流变学特征,利于后续分离纯化过程。是进行分离纯化一个工序。

2.过滤发酵液在萃取之前需预处理,发酵液加少许絮凝剂沉淀蛋白,然后经真空转鼓过滤或板框过滤,除掉菌丝体及部分蛋白。青霉素易降解,发酵液及滤液应冷至10℃以下,过滤收率通常90%左右。

（1）菌丝体粗长10µm,采取鼓式真空过滤机过滤,滤渣形成紧密饼状,轻易从滤布上刮下。滤液pH6.27-7.2,蛋白质含量0.05-0.2%。需要深入除去蛋白质。

（2）改善过滤和除去蛋白质方法:硫酸调整pH4.5-5.0,加入0.07%溴代十五烷吡啶PPB,0.7%硅藻土为助滤剂。再经过板框式过滤机。滤液澄清透明,进行萃取。

3.萃取青霉素提取采取溶媒萃取法。青霉素游离酸易溶于有机溶剂,而青霉素盐易溶于水。利用这一性质,在酸性条件下青霉素转入有机溶媒中,调整pH,再转入中性水相,反复几次萃取,即可提纯浓缩。选择对青霉素分配系数高有机溶剂。工业上通常见醋酸丁酯和戊酯。萃取2－3次。从发酵液萃取到乙酸丁酯时,pH选择1.8-2.0,从乙酸丁酯反萃到水相时,pH选择6.8-7.4。发酵滤液与乙酸丁酯体积比为1.5-2.1,即一次浓缩倍数为1.5-2.1。为了避免pH波动,采取硫酸盐、碳酸盐缓冲液进行反萃。发酵液与溶剂百分比为3－4。几次萃取后,浓缩10倍,浓度几乎达成结晶要求。萃取总收率在85％左右。

所得滤液多采取二次萃取,用10%硫酸调pH2.0~3.0,加入醋酸丁酯,用量为滤液体积三分之一,反萃取时常见碳酸氢钠溶液调pH7.0~8.0。在一次丁酯萃取时,因为滤液含有大量蛋白,通常加入破乳剂预防乳化。第一次萃取,存在蛋白质,加0.05-0.1%乳化剂PPB。

萃取条件:为降低青霉素降解,整个萃取过程应在低温下进行（10℃以下）。萃取罐冷冻盐水冷却。

4.脱色萃取液中添加活性炭,除去色素、热源,过滤,除去活性炭。

5.结晶萃取液通常经过结晶提纯。青霉素钾盐在醋酸丁酯中溶解度很小,在二次丁酯萃取液中加入醋酸钾-乙醇溶液,青霉素钾盐就结晶析出。然后采取重结晶方法,深入提升纯度,将钾盐溶于KOH溶液,调pH至中性,加无水丁醇,在真空条件下,共沸蒸馏结晶得纯品。

直接结晶:在2次乙酸丁酯萃取液中加醋酸钠－乙醇溶液反应,得到结晶钠盐。加醋酸钾－乙醇溶液,得到青霉素钾盐。

共沸蒸馏结晶:萃取液,再用0.5MNaOH萃取,pH6.4-4.8下得到钠盐水浓缩液。加2.5倍体积丁醇,16－26℃,0.67-1.3KPa下蒸馏。水和丁醇形成共沸物而蒸出。钠盐结晶析出。结晶经过洗涤、干燥后,得到青霉素产品。六、用药相关1青霉素类毒性很低,但较易发生变态反应,发生率约为5%10%。多见为皮疹、哮喘、药品热、严重可致过敏性休克而引发死亡。2大剂量应用青霉素抗感染时,可出现神经精神症状,如反射亢进、知觉障碍、抽搐、昏睡等,停药或降低剂量可恢复。3使用青霉素前必需作皮肤过敏试验。假如发生过敏性休克,应立刻皮下或肌内注射0.1%肾上腺素0.5ml～1ml,同时给氧并使用抗组胺药品及肾上腺皮质激素等。4肌注钾盐时局部疼痛较显著,用苯甲醇溶液作为稀释剂溶解,则可消除疼痛。【参考文件】:【1】长久有效青霉素不一样注射方法效果比较中国误诊学杂志/02中