用水水源地水质监测预警斑马鱼卵法

1饮用水水源地水质监测预警斑马鱼卵法本文件规定饮用水水源地水质监测预警的斑马鱼卵法。本文件适用于饮用水水源地水质监测预警。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。HJ1069-2019水质急性毒性的测定斑马鱼卵法HJ/T91地表水和污水监测技术规范HJ/T164地下水环境监测技术规范HJ773-2015集中式饮用水水源地规范化建设环境保护技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1hpfhourspost-fertilization（hpf）：受精后小时数；3.2dpfdaypostfertilization（dpf）：受精后天数；3.3hoursafterinfection（hpi）：感染后小时数；3.4斑马鱼胚胎成年雌雄斑马鱼配对后产出的受精卵，一般指0-72hpf未出膜的斑马鱼胚胎；3.5斑马鱼卵本文件中斑马鱼卵指斑马鱼胚胎和幼鱼；3.6野生型斑马鱼自然环境中或实验室条件下，未经过人为基因改造或碱基突变的斑马鱼品系；3.7突变体和荧光标记转基因斑马鱼突变体指通过基因编辑使目标基因发生功能缺失的斑马鱼品系；荧光标记转基因斑马鱼是指通过转基因技术将特异基因启动子驱动的荧光蛋白基因整合到基因组，并获得荧光标记稳定遗传的斑马鱼品系；23.8存活率存活斑马鱼卵数量占斑马鱼卵总数的比率；3.9斑马鱼卵死亡0-24h出现卵凝结或24hpf以后的胚胎没有出现心跳；3.10环境胁迫重金属或病原微生物等污染物对生物包括斑马鱼或其胚胎、幼鱼造成的不利影响；3.11畸形斑马鱼指在发育过程中因遗传变异、环境胁迫或实验干预导致的持续性结构异常，其特征需满足：可观测性、不可逆性、功能性影响；3.12畸形率差异畸形斑马鱼数量占斑马鱼数量总数的比率，指在特定条件下（如暴露于某种风险因素，观察到的畸形发生率与对照组的畸形率之间的差异；3.13荧光强度转基因斑马鱼受精胚胎或幼鱼，在荧光显微镜特定波长（488nm）的激发光照射下，阳性细胞会发出绿色荧光，通过显微镜拍摄影像，统计后的相对数值。荧光强度相对数值统计方法详见附录C。3.14阳性细胞在特定启动子驱动下能够合成特定的荧光蛋白（GFP/RFP），在荧光显微镜特定波长（488/587nm）的激发光照射下能够发出绿色/红色荧光的细胞；3.15P值是用来判定环境胁迫后突变体斑马鱼卵存活率或转基因斑马鱼胚胎或幼鱼荧光强度差异性的参数，P值越小，表明差异越显著。差异结果可指示环境胁迫的生物学效应。P值计算方法详见附录D。4方法原理本方法使用经筛选的3种类型共4个品系的斑马鱼，包括野生型WT，突变体prdm15-/-及转基因型Tg（XlEef1a1:mlsEGFP）与Tg(corola:EGFP)斑马鱼卵。利用野生型WT与突变体prdm15-/-斑马鱼卵在不同环境胁迫下的存活情况及转基因型Tg（XlEef1a1:mlsEGFP）与Tg(corola:EGFP)斑马鱼卵在不同环境胁迫下荧光差异来表征水源地水质状况，并以此来开展水质监测预警。5遗传管理5.1已获取国家授权专利的环境敏感性突变体斑马鱼prdm15-/-应获得华中农业大学水产学院刘静霞教授实验室授权后引种。转基因斑马鱼Tg(XlEef1a1:mlsEGFP）、Tg(corola:EGFP)、野生型斑马鱼WT，应在国家斑马鱼资源中心或具相关资质部门进行引种。5.2本标准使用的突变体与转基因斑马鱼应保持群体较高的遗传纯合度，引种的数量根据需求确定，采用全同胞兄妹。35.3传代亲本应选择3月龄以上的健康成熟个体。5.4对于实验鱼的引种、传代过程应建立种名、来源、数量、雌雄比例、繁育生产等情况的谱系档案，对突变体和转基因斑马鱼严格进行管理，避免基因污染。5.5种鱼在配对前应进行加喂饲养，保证种鱼的健康及鱼卵的品质。实验前一天下午喂食后，选取健康的种鱼，雌雄比为2：3或3：4，置于配种缸中，并使用隔板将雌雄分开，使用遮光布避光，次日早上打开遮光布，抽离隔板，自由交配30-60min后收集鱼卵。通过基因遗传型和荧光标记筛选，挑选鱼卵用于生物预警监测。6干扰和消除使用斑马鱼卵进行水质监测时，须使用同批次斑马鱼卵设置参照组，同步开展对照监测实验。同时控制实验水温在25±1℃,pH介于6.5-8.5之间，溶解氧饱和度保持在6mg/L以上，以消除其他环境因素的影响。7试剂和材料7.1受试生物7.1.1种鱼用于饮用水水源地水质监测的斑马鱼包括野生型WT，突变体prdm15-/-，转基因Tg（XlEef1a1:EGTg（corola:EGFP)4个品系。受试生物应选用健壮、无疾病、无畸形、产卵量及受精率高的斑马鱼作为种鱼用于产卵，鱼龄在6～24月之间。健康雌鱼腹部银亮，饱满膨大。健康雄鱼体型修长，腹部扁平，身体带有金黄色光泽。种鱼在产卵前6个月不予使用任何药物。各品系种鱼的选育参照附录A。种鱼驯养及维持条件参照HJ1069-2019附录B。7.1.2斑马鱼卵确保实验鱼卵处于4～128细胞期。受精鱼卵辨别参照HJ1069-2019附录D，斑马鱼卵相关发育阶段参照HJ1069-2019附录A。7.2试剂7.2.1标准稀释水用于阴性对照实验及斑马鱼卵培养，标准稀释水的配置参照HJ1069-2019中6.2.16。7.2.2蒸馏水用于检测单位、对照单元的斑马鱼卵培养皿清洗。8仪器和设备8.1pH电子测试计:测量范围0-14pH，最小分度为0.1pH；8.2电子温度计:测量范围0~50℃;8.3溶解氧测定仪:测量范围0mg~20mg/L，最小分度为0.1mg/L；8.4恒温培养箱或恒温室:温度可调至28±1℃;8.5斑马鱼养殖系统:包括净水、储水、供水、水质控制及循环等系统；8.6产卵盒；8.7全自动电子体式荧光显微镜；8.8一般实验室常用培养斑马鱼的器皿和设备，如斑马鱼卵培养24孔板等。49监测预警系统9.1系统构成饮用水水源地及其它地表水水质监测预警系统由采配水单元、检测单元、对照单元、控制单元、数据分析单元组成。9.2采配水单元采配水单元应保证所提供的水样可靠有效并具有代表性，包括采水单元、预处理单元和配水单元。采水单元包含采水泵、采水管路铺设等。预处理单元为预处理装置，包括水温控制、pH检测、溶解氧饱和度检测，以确保水温稳定，pH及溶解氧饱和度满足检测要求。配水单元向检测单元在线监测设备供水，其提供的水压和水量均需满足要求。9.3检测单元该单元是受试生物斑马鱼卵检测单元，是系统核心部分；须建立恒温系统，确保检测环境稳定以消除干扰；建立斑马鱼卵荧光强度及存活情况定时检测系统，实现对待测样本的在线分析；确保检测数据科学准确稳定，检测模块输出的稳定持续运行。该单元宜经久耐用且易于清洗维护，二次污染小。9.4对照单元该单元用于阴性阳性对照实验，将同批次受试生物斑马鱼卵置于标准稀释水环境，并保持恒温环境（28±1℃),与检测单元同步展开监测。对照实验所需试剂须提前配置好置于对照单元内，并定时定量补充，确保对照实验环境稳定以消除干扰。9.5控制单元该单元主要用于监测系统控制，主要包括采水单元采水量、预处理单元水温控制、配水单位水压水量控制、检测单元温度控制及进水样与排液控制、对照单元温度控制及工作液控制。9.6数据分析单元该单元主要是按分析周期提取检测单元及对照单元在线监测设备的监测结果，按照设定好的预警机制（见）进行分析并呈现结果。该单元包括数据传输、分析、记录存储。10试验步骤10.1受试生物准备10.1.1配种试验监测周期为72h，每次试验前须提前一天配种，配种方法参照HJ1069-2019中9.1。10.1.2产卵及鱼卵初筛产卵及鱼卵初筛参照HJ1069-2019中9.2，选取已受精的斑马鱼卵作为受试生物材料，按斑马鱼品系置于不同培养皿培养待用，培养液为标准稀释水。10.2试验开展10.2.1受试鱼卵选取将培养皿在倒置显微镜或体视显微镜下逐一进行观测，去除在胞分裂时有明显异常(如不对称、有囊泡或无卵膜等)或者卵膜损伤的鱼卵，选取圆润、饱满、完整的4128细胞期受精卵，每个品系选择150枚。10.2.2斑马鱼卵分配将选取的斑马鱼卵按24孔板不同行进行放置，分别放置WT、prdm15-/-、Tg（XlEef1a1:EGFP）、Tg（corola:EGFP)斑马鱼卵，每个孔随机挑选25枚卵放置。每个样本3个平行。水样监测组和对照组平5行放置各一个带4个品系样本的24孔板（实验和对照组每个品系是3个孔，每个孔25个卵，所以是每个品系150枚卵）。10.2.3水样接入及排液检测单元接入配水系统及排液系统，要求控制进出水流量保持一致，且取水后30min内水样可至检测单元，同时需注意进出水不得对斑马鱼卵造成冲击压力，避免试验干扰。检测单元流出水样经细密筛网过滤（筛网网眼大小应小于鱼卵，防止鱼卵流出）后，排入原水体。对照单元接入工作液，定时补充自然蒸发等消耗的工作液，不排液。10.2.4试验观察全自动电子体式荧光显微镜每2h按顺序对每个24孔板自动拍摄一次，拍摄影像传输至数据分析单元，系统自动辨识读取检测结果，包括斑马鱼卵荧光强度及存活情况。10.3试验结果统计分析10.3.1斑马鱼卵死亡率差异分析试验期是0-24h，数据分析单元根据拍摄影像中的斑马鱼卵是否出现卵凝结或是否有心跳的特征来判断斑马鱼卵的存活情况，判断方法参见HJ1069-2019中9.4及附录D.2。分别统计对照组、监测单元野生型WT、突变体prdm15-/-斑马鱼卵存活率。将不同品系的所有平行组存活率统计完成后，使用GraphPadPrism8.0对野生型与突变体的存活率在品系间进行t检验。10.3.2突变体斑马鱼畸形率和转基因斑马鱼荧光强度差异分析试验期是24-72h，数据分析单元根据拍摄影像中的对照组和试验组转基因斑马鱼影像通过ImageJ对荧光细胞的平均荧光强度进行定量，同时，结合根据突变体斑马鱼的发育畸形差异，将不同品系所有平行组平均荧光强度或发育畸形率定量完成后，使用GraphPadPrism8.0对相同品系的对照组与试验组在品系内进行t检验。10.4试验终止当进水水样溶解氧低于5mg/L或pH值超出正常值（6-9地表水3类水则试验终止，并做一级预警。10.5试验终点以72h为一个周期，72h后需要对试验进行终止。10.6试验材料更换试验每个周期，须更换新的受试生物材料及试剂，包括检测单元与对照单元装有斑马鱼卵的24孔板、对照单元的工作液。10.7系统维护须定期对监测仪器进行校准。10.8废弃物处置试验用斑马鱼卵放入冰水混合液（冰的体积不少于50%）中30min以上进行灭活处理后按一般废弃物处置。11结果显示与表示11.1结果有效性判断当对照试验斑马鱼卵存活率不低于90%，则结果有效。11.2预警结果显示6系统根据野生型斑马鱼卵与突变体斑马鱼卵的存活率和畸形率以及转基因型斑马鱼的荧光差异来表征水质状况，并做预警结果显示。.不预警：prdm15-/-与WT存活率均≥80%±5%（ns/p＜0.05）（0-24hpf）；prdm15-/-与WT畸形率≤0%±5%（24-72hpf）；转基因斑马鱼实验组与对照组荧光强度不具有显著性差异（ns/p＜0.05）（24-72hpf），则设定为不预警。不符合该情况向下一级判定，若在本级与下级均符合部分条件，则取本级预警。.三级预警/生态预警：prdm15-/-存活率＜80%±5%，与WT存活率存在显著性差异（p＜0.01）（0-24hpf）；prdm15-/-与WT畸形率≤0%±5%（24hpf-72hpf）；转基因斑马鱼实验组与对照组荧光强度具有显著性差异***（p＜0.001）（24-72hpf），则设定为三级预警/生态预警。不符合该情况向下一级判定，若在本级与下级均符合部分条件，则取本级预警。.二级预警：prdm15-/-与WT存活率均＜80%±5%，且prdm15-/-与WT存活率存在显著性差异（p＜0.01prdm15-/-与WT畸形率≤10%±5%，且差异性显著（p＜0.0124hpf-48hpfprdm15-/-与WT畸形率≤5%±5%，且具有差异性（p＜0.05）（48hpf-72hpf）；转基因斑马鱼实验组与对照组荧光强度具有显著性差异***（p＜0.001）（24-72hpf），则设定为二级预警。不符合该情况向下一级判定，若在本级与下级均符合部分条件，则取本级预警。.一级预警：prdm15-/-与WT存活率均＜60%±5%，且prdm15-/-与WT存活率存在显著性差异（p＜0.010-24hprdm15-/-与WT畸形率≤20%±5%，且差异性显著（p＜0.0524hpf-48hpf或prdm15-/-与WT畸形率≤10%±5%，且差异性显著（p＜0.0548-72hpf转基因斑马鱼实验组与对照组荧光强度具有显著性差异***（p＜0.001）（24-72hpf），则设定为一级预警。表1预警阈值限定判断条件预警等级存活率差异畸形率差异荧光强度差异0-24hWT≥80%±5%，//不预警prdm15-/-Tg(XlEef1a1:mlsEGFP)///Tg(coro1a:EGFP)24-48hWT/≤0%±5%/prdm15-/-Tg(XlEef1a1:mlsEGFP)//ns/*（P<0.05）Tg(coro1a:EGFP)48-72hWT/≤0%±5%/prdm15-/-Tg(XlEef1a1:mlsEGFP)//ns/*（P<0.05）Tg(coro1a:EGFP)Tg(coro1a:EGFP)0-24hWTprdm15-/-<≤0%±5%/三级预警/生7prdm15-/-80%±5%，**（p＜0.01）态预警Tg(XlEef1a1:mlsEGFP)///Tg(coro1a:EGFP)24-48hWT/≤0%±5%/prdm15-/-Tg(XlEef1a1:mlsEGFP)//***P<0.001Tg(coro1a:EGFP)48-72hWT/≤0%±5%/prdm15-/-Tg(XlEef1a1:mlsEGFP)//***P<0.001Tg(coro1a:EGFP)0-24hWT（p＜0.01）//二级预警prdm15-/-Tg(XlEef1a1:mlsEGFP)//***P<0.001Tg(coro1a:EGFP)24-48hWT/≤10%±5%（p＜0.01）/prdm15-/-Tg(XlEef1a1:mlsEGFP)//***P<0.001Tg(coro1a:EGFP)48-72hWT//prdm15-/-Tg(XlEef1a1:mlsEGFP)//***P<0.001Tg(coro1a:EGFP)Tg(coro1a:EGFP)0-24hWT＜60%±5%，**（p＜0.01）≤0%±5%/一级预警prdm15-/-Tg(XlEef1a1:mlsEGFP)//P<Tg(coro1a:EGFP)80.00124-48hWT/≤20%±5%p<0.05）/prdm15-/-Tg(XlEef1a1:mlsEGFP)//***P<0.001Tg(coro1a:EGFP)48-72hWT/≤10%±5%，*（p<0.05）/prdm15-/-Tg(XlEef1a1:mlsEGFP)//***P<0.001Tg(coro1a:EGFP)本标准根据实验室团队实验测得数据，并参考已有标准中的规定，同时考虑到饮用水水源地存在的背景值差异性及敏感程度不同，提出可用仪器进行一定时间的水质毒性背景值测试，根据实测数据范围同时考虑实际管理工作的需要调试来确定分级预警。表2技术指标9（资料性）实验鱼突变位点与荧光蛋白DNA检测引物及序列实验鱼突变位点与荧光蛋白检测引物及序列分别见表A.1、表A.2。表A.1实验鱼突变位点与荧光蛋白DNA检测引物序列（5’-3’）prdm15-/-表A.2实验鱼突变位点与荧光蛋白DNA序列实验鱼序列（5’-3’）prdm15-/-TCCTACTATGGATGCTTATGGCTATTCATTTTCAACATTATTCAAGATATTGTGTTTAATTGCAGACACACAAACAGGTTTGAAGCAAGTGAAGAGTGAGGAAATAATGACAGAATTTAAGTTTTTGAGTGAACTGTTCCTTTAAGTATTTAGCAGTGTCTTTGTTTGATGGCATAATTTCTCATGTGACTGTCGTTGCTGCAGGGTGTGAGGACTGTGGGCAGTATCATGACTCTGAATGTCCTGAACTGGGGCCTGTCGTCACAGTGAGGGACTCGTTTGTTTTGAGTCGGGCACGGTGAGTGGCCATCCGTGGCTTTTGGGCTATTGCCTTCTGAGTGGGTCTTGGCACAGCAGTGACCACAATTAGATGGCCATATGTTCTGTTTTCAAAGGCCAGTg（XlEef1a1:EGFP）TTAGAAGAGATTCCAAAACTTGAAGTTTATAAGTCAAACAAGGGAGACATCCAAAATATGTACTGTTGGTGCGCCTCCAGGAACAGGGTTGGGAAACATTGGACTAACTAACAACAGTACAAATGGCTCAGGCGCAAAAACTACAACACCCACAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAATg（corola:EGFP)TTGTCCAATGCCTACTAAAAATATGGTAGCAACATGCTAATTCATTTTAGAAACATGCTAGTAACATGCTAATTCATGTTAGAATAATGCTAGTACATGTTAATTCATATTGGAATTATACTAACACCATGCTTATTTGTGTTAGAAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA种鱼的筛选与鉴定B.1突变体种鱼选育B.1.1突变体的构建B.1.1.1gRNA靶点选择B.靶位点的预测在Ensemble中查找prdm15基因的完整序列，通过/SSC/和/网站分别对靶位点序列特征和脱靶可能性打分，进行靶位点预测B.靶位点的选择靶位点尽量选择在基因编码序列的前2/3区域，并在ATG之后；将靶位点序列在Ensembl网址进行BLAST，确保其唯一性。B.测序确认靶点序列在靶位点周围的基因组序列上设计引物，使其距离靶位点两侧都大于100bp，扩增靶位点及附近序列送测序，确认靶位点是否可用。B.1.1.2RNA体外合成设计高活性的single-guideRNA（gRNA），以gRNA质粒为模板进行PCR扩增，扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，并对PCR产物进行回收，并进行体外转录。B.1.1.3Cas9mRNA合成通过单酶切线性化Cas9质粒，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并回收，随后进行体外转录。B.1.1.4显微注射将Cas9mRNA（500ng/μL）和gRNA(80ng/μL)等体积混匀，通过显微注射到单细胞期斑马鱼胚胎中，每个靶点至少注射300颗胚胎，同时留一些胚胎作为对照，统计死亡率及畸形率。B.1.1.5F0靶点突变检测和可遗传筛选取20颗注射组胚胎