生化分离技术标准教案

生化分离技术

生化系生物学教研室

授课内容第一章绪论授课时间4学时

教学目的

熟悉生物物质的概念、种类和来源；

了解分离纯化技术及其基本原理；

熟悉分离纯化工艺的优化、放大和验证工作；

掌握分离纯化的特点与一般步骤；

了解生物分离纯化技术的发展历史；

熟悉生物分离纯化技术的发展趋势。

教学重点

生物物质的概念、种类和来源；分离纯化工艺的优化、放大和验证工作；分离纯

化的特点与一般步骤；生物分离纯化技术的发展趋势。

教学难点

分离纯化技术及其基本原理；分离纯化工艺的优化、放大和验证工作。

教学课型新授教学方法讲授法

第一节生物分离与纯化的概念与原理

一、生物物质的概念、种类和来源

1.生物物质：氨基酸及其衍生物类、活性多肽类、蛋白质、酶类、

核酸及其降解物、糖、脂类、动物器官或组织制剂、小动物制剂、

菌体制剂。

2.生物物质来源：动物器官与组织、植物器官与组织、微生物及

其代谢产物、细胞培养产物、血液、分泌物及其代谢物

二、生物分离纯化概念

指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液或动植物组织细

胞与体液等中分离、纯化生物产品的过程。

三、生物分离纯化技术

生物技术

上游：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程及组织工程；

下游：生物产品的回收——生物分离与纯化技术，主要包括离心

技术、细胞破碎技术、萃取技术、固相析出技术、色谱技术和膜

分离技术等。

四、分离纯化基本原理

有效识别混合物中不同组分间物理、化学和生物学性质的差

别，利用能够识别这些差别的分离介质或扩大这些差别的分离设

备来实现组分间的分离或目标产物的纯化。

原理分离纯化技术产物举例

电泳蛋白质、核酸、氨基酸

带电性离子交换色谱氨基酸、有机酸、抗生素、

等电点沉淀蛋白质、核酸

蛋白质、氨基酸

电渗析氨基酸、有机酸、盐、水

化学性质离子交换色谱氨基酸、有机酸、抗生素、

亲和色谱蛋白质、核酸

蛋白质、核酸

生物功能特性亲和色谱蛋白质、核酸

疏水色谱蛋白质、核酸

原理分离纯化技术产物举例

离心菌体、细胞碎片、蛋白质

分子大小、形超滤蛋白质、多醵、抗生素

状微滤菌体、细胞

透析尿素、盐、蛋白质

电渗析氨基酸、有机酸、盐、水

凝胶色谱盐、分子大小不同的蛋白质

萃取氨基酸、有机酸、抗生素、

盐析蛋白质、香料

溶解度、挥发结晶蛋白质、核酸

性蒸镭氨基酸、有机酸、抗生素、

等电点沉淀蛋白质

有机溶剂沉淀乙醇、香精

蛋白质、氨基酸

蛋白质、核酸

第二节分离纯化策略

一、生物分离纯化技术的特点

1.环境复杂、分离纯化困难

2.含量低、工艺复杂

3.稳定性差、操纵要求严格

4.目标产物最终的质量要求很高

5.终极产品纯度的均一性与化学分离上纯度的概念并不完全相同

二、分离纯化方法选择的原则

1.技术路线、工艺流程尽量简单化；

2.尽可能采用低成本的材料与设备；

3.将完整工艺流程划分为不同的工序；

4.注意时效性；

5.采用成熟技术和可靠设备；

6.准备好书面标准操作程序等技术文件；

7.检测纯化过程中产物产量和活性

三、分离纯化的原材料选择与成品保存

1.原材料的选择

(1)来源

(2)与目标产物含量相关的因素

①合适的生物品种

②合适的组织器官

③生物材料的种属特异性

④合适的生长发育阶段

⑤合适的生理状态

2.天然生物材料的采后处理

天然生物材料需要处理的原因

①细胞自溶导致目标产物失活或降解；

②易受微生物污染导致目标产物失活或降解。

③易受光照、氧气等的作用导致其分子结构改变。

一般植物材料需进行适当的干燥后再保存，动物材料需经清洗后

速冻、有机溶剂脱水或制成丙酮粉在低温下保存。

3.成品的保存

(1)影响生物产品保存的主要因素

①空气②温度③水分④光线⑤pH⑥保存期

(2)蛋白质和酶制品的保存方法

①低温下保存②制成干粉或结晶保存③保存时添加保护剂

四、分离纯化的准备工作

1.软件材料的准备

2.硬件材料的准备

五、分离纯化的基本步骤

胞外产物

发酵液一-预处理--细胞分离一-细胞破拜一►细胞碎片分离羊一初步纯化一►

加热沉降匀化离心分离沉淀

调pH值离心分离研磨萃取吸附

紫凝过滤溶胞过滤萃取

超旋

—►高度纯化一►成品加工

层析无菌过滤

寓子交换超滤

吸附冷冻干燥

电泳喷雾干燥

结品

六、分离纯化技术的综合运用与工艺放大

一种合格产品要运用多种分离设备和技术进行纯化，原因为：

①在每个工序中根据现有设备条件和目标产物的性质、规格、用

途不同可采用多种分离纯化手段；

②每种分离纯化操作本身各项影响加工效果的因素都直接影响分

离纯化的效果和成本；

③各工序间具有复杂的相互影响作用。

1.建立在制品、半制品成品上的检测方法是工艺优化的前提

2.明确优化工艺的评判标准，处理好收率、纯度、经济性之间的

平衡

应将处理体积大、加工成本低的工序尽量前置，而价格昂贵、

精制工序易放在工艺流程的后段。随产物纯度的提高，对工艺流

程下游加工所用的设备、试剂的要求亦提高。

七、分离纯化的中试放大

1.中试放大具备的条件

①确定并系统鉴定了生物材料的资源

②目标产物的收率稳定即重复性好，质量可靠

③工艺路线和操作条件已经确定，并且已经建立了原料、半制品、

产品的的分析检测方法

④已经进行过物料平衡预算，并且建立了“三废”的处理和监测方

法

⑤确立了中试规模及所需原材料的规格和数量

⑥建立了教完善的安全生产预警措施和方法

2.中试放大中力求解决及注意的问题

⑴进一步确定生产中所需原辅料的规格和来源

⑵进一步确定生产设备的选型与设备材料的质量

⑶进一步确定分离纯化操作的条件限度

(4)研究和建立原辅材料、中间体及产品质量的分析方法和手段

3.中试放大的方法

经验放大法、相似放大法、数学模型放大法、步步为营法、一竿

子插到底法

4.中试放大的关键环节

①工艺路线及各工序操作步骤

②设备材质与型号的选择

③原辅材料、中间体的质量标准

④操作条件

⑤物料衡算

⑥安全生产与“三废”防治

⑦原辅材料、中间体及产品的理化和生物学测定

⑧消耗定额、原料成本、操作工时与生产周期等的计算

八、生物药品生产工艺的验证

1.验证的概念

证明任何程序、生产过程、设备、物料、活动或系统确实能达到

预期结果的有文件明的一系列活动。

2.药品生产验证的主要内容

设备与厂房和公用设施验证、工艺验证、清洁验证、分析方法验

证、计算机验证

3.生产工艺验证

①关键工艺步骤的验证

②关键工艺参数的验证

③工艺一致性验证

第三节生物分离纯化技术的发展

一、生物分离纯化技术的发展历史

1.古代酿造业

包括酿酒、制酱（油）、醋、酸奶和干酪等，都是家庭作坊式的，

产物基本不经过后处理而直接使用。

2.原始分离纯化时期（第一代生物技术产品）

主要指19世纪60年代到20世纪40年代青霉素等抗生素出现之

前的生物技术产业。

3.传统分离纯化方法推广使用时期（传统第二代生物技术产品）

以青霉素产品的出现为代表。这一时期的特点是产品类型多，分

子结构较为复杂，对分离纯化提出了更高要求。这期间引进吸收

了大量的近代化学工业的分离技术，据报道有80%的化工单元操

作技术被引进生物工业。

4.快速发展时期（第三代生物技术产品）

一般认为以20世纪70年代末崛起的DNA重组技术及细胞融合技

术为代表。如乙肝疫苗、干扰素等一批对人类十分有益的高附加

值的产品开始面世，生物下游技术领域的研究和开发力度不断加

大，推出新技术。

二、生物分离纯化技术的发展趋势

1.多种分离纯化技术和新、老技术的相互交叉、渗透和融合

2.强化化学作用对分离纯化过程的影响

3.注重上游技术的改进，简化分离纯化过程

4.由环境污染向清洁生产工艺转变

本章作业

1、生物分离工程在生物技术中的地位？

2、生物分离工程的特点是什么？

3、生物分离工程可分为几大部分，分别包括哪些单元操作？

4、在设计下游分离过程前，必须考虑哪些问题方能确保我们所设计的工艺过程

最为经济、可靠？

教学后记

生化分离技术

生化系生物学教研室

授课内容第二章过滤授课时间4学时

教学目的

1、了解过滤的概念

2、掌握过滤的基本形式

3、了解凝聚和絮凝的区别

4、了解常用的絮凝剂有哪些

5、了解过滤设备分类

6、了解常用过滤设备及其特点

教学重点

1、过滤的基本形式

2、凝聚和絮凝的区别

3、常用的絮凝剂有哪些

4、过滤设备分类

教学课型新授教学方法讲授法

一、过滤的基本概念

过滤是在某一支撑物上放过滤介质，注入含固体颗粒的溶液，

使液体通过，固体颗粒留下，是固液分离的常用方法之一。

二、过滤前物料的前处理

通常发酵液和生物溶液是高粘度的和非牛顿流体,是很难过

滤的，为了加快过滤速度，通常可采用以下方法：

1、加热(Heating)降低液体粘度

2、凝聚和絮凝(Coagulationandflocculation)在电介质作

用下，破坏溶质胶体颗粒表面的双电层，破坏胶体系统的分散

状态，使胶体粒子聚集的过程

三、影响凝聚作用的主要因素

简单电解质降低胶体间的排斥力。从而范德华引力起主导作

用，聚合成较大的胶粒，粒子的密度越大，越易分离。

1、无机盐的种类

2、无机盐的化合价

3、无机盐的用量PAMFlocculation

常用的凝聚剂有：

A12(SO4)3.18(H2O),

A1C13.6(H2O),FeCb,

ZnSO4,MgCO3

四、絮凝作用

(Flocculation)

概念：指在某些高分子

絮凝剂存在下，在悬浮

粒子之间发生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程

合成助滤剂既降低静电斥力又吸附周围的微粒，形成桥架作

用。胶粒过大，就发生絮凝，低密度聚合的胶粒，容易过滤。

聚合电解质有阳离子型、阴离子型或非离子型。

六、常用的絮凝剂

1、天然聚合物

多糖类物质、海藻酸钠、明胶等

2、人工合成聚合物

聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物、聚丙烯酸类等

六、助滤剂

1、目的：助滤剂是一种具有特殊性能的细粉或纤维，它能使某

些难以过滤的物料变得容易过滤

2、常用的助滤剂：

硅藻土(Diatomaceousearths)

珍珠岩(Perlites)

七、过滤设备及其结构

过滤设备的分类

根据推动力的不同可分为四类

(a)重力过滤自然过滤

(b)加压过滤板框过滤

(c)真空过滤真空过滤器

(d)离心过滤离心过滤器

八、过滤介质

1、无定形颗粒：颗粒活性炭、沙、无烟煤

2、成形颗粒：烧结金属、烧结塑料

3、非金属织物：尼龙、玻璃纤维

4、金属织物：不锈钢丝网

5、无纺品：纸、石棉

九、典型的过滤设备

1、板框压滤机

优点：结构简单、过滤面积大、操作压力高、适用范围广

缺点：设备笨重、间歇操作、劳动强度大、辅助时间长

2、旋转过滤机

可实现连续操作

本章作业

1、何谓过滤

2、过滤的基本形式

3、凝聚和絮凝的区别

4、常用的絮凝剂有哪些

5、过滤设备分类

6、常用过滤设备及其特点

教学后记

生化分离技术

生化系生物学教研室

授课内容第三讲离心与沉降授课时间2学时

教学目的

通过本章学习应该掌握的内容

1、何谓沉降

2、沉降与离心的异同

3、沉降与离心的速度方程

4、离心设备可分为哪两大类

教学重点(难点)

沉降与离心的异同

沉降与离心的速度方程

教学课型新授教学方法讲授法

一、离心的概念

基于固体颗粒和周围液体密度存在的差异，在离心场中使不

同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程

实际上离心和过滤一样，也是固液分离的一种单元操作

对于一些固体颗粒小、溶液粘度大的生物体系，过滤实际上

是很难进行的，必须采用离心技术方

能达到目的

二、沉降的概念

沉降：是指当悬浮液静置时，密

度较大的固体颗粒在重力的作用下

逐渐下沉，这一过程成为沉降

沉降过程通常是十分缓慢的，对

于一些固液密度差异很小的体系沉

降往往需栗很长时间

三、沉降速率方程

当一固体微粒通过连续介质时，它的运动速度受到两种力的

作用：

1、由于密度差引起的浮力

2、微粒受到的流体阻力

四、重力沉降式液固分离设备

1、特点：

设备简单、运行成本低、能耗低

体积庞大、分离效率低

2、传统的沉降设备：

(a)矩形水平流动池

(b)圆形径向流动池

(c)斜板与斜管式沉淀池

五、离心式沉降分离

1、分类：

(a)离心沉降

(b)离心过滤

2、离心沉降

利用悬浮液或乳浊液中密度不同的组分在离心力场中迅速沉

降分层，实现固液分离

操作方式：间歇式、连续式

型式：管式、套筒、碟片式

(1)管式离心机(Tubularbowl)

(2)碟片式离心机(Disctypecentrifuge.)

3、离心过滤

使悬浮液在离心力场作用下产生的离心力压力，作用在过滤

介质上，使液体通过过滤介质成为滤液，而固体颗粒被截留在过

滤介质表面，从而实现固液分离，是离心与过滤单元操作的集成，

分离效率更高

4、常见的离心过滤设备

(a)三足式离心机

是最常见的过滤式离心机,立式有孔转鼓悬挂于三根支足上故而

得名

(b)卧式刮刀离心机

可连续生产，使用效率更高，功率消耗小

(c)螺旋卸料离心机

主要用于需耐压的场合，具较高的分散因数

本章作业

1、何谓沉降

2、沉降与离心的异同

3、沉降与离心的速度方程

4、离心设备可分为哪两大类

5、常用的离心沉降设备有哪些

6、常用的离心过滤设备有哪些

教学后记

生化分离技术

生化系生物学教研室

授课内容第四讲细胞破碎授课时间4学时

教学目的

通过本章学习应掌握的内容

1、细胞破碎的意义

2、常用的细胞破碎方法

3、渗透压计算方法

4、了解机械破碎法所用设备

5、渗透压的计算

教学重点（难点）

常用的细胞破碎方法

机械破碎法所用设备

教学课型新授教学方法讲授法

一、细胞破碎的目的

由于有许多生化物质存在于细胞内部，必须在纯化以前将细胞

破碎，使胞内物质释放到液相中，然后方可进行提取

二、细胞膜

本节主要探寻细胞膜的物质结构及我们所面对的几个复杂问题。

现在所有的关于细胞膜结构的基本知识，并不能为细胞破碎方法提

供基本的引导。也许将来可以。正因如此，对此进行提纲切领的介

绍很有必要。主要强调的是革兰氏阴性原核生物。其细胞结构中没

有细胞核：基因物质位于单链DNA上。典型的生物是大肠杆菌，

是生物技术研究的主体。通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物

三、细胞破碎的主要方法

化学法

（1）渗透冲击：无论动物还是植物细胞，胞内物质都是由膜组织

包裹起来的，因此，破坏细胞膜系统是胞内物质释放的

关键步骤

通常细胞膜系统强度较差，易受渗透压冲击而破碎

（最简单的是渗透冲击法。此法将一定体积的细胞液加到2倍体

积的水中，细胞中溶质浓度高，水不断进入细胞，使细胞膨胀，最

后导致破裂。细胞破裂后释放到周围环境中的胞内物可用后面章节

介绍的方法分离。）

渗透压的计算方法

RT

Pout~Pin=ln（l一X］）

VH2O

（2）酶消化：酶法破坏细胞膜系统

酶消化法的缺点在于酶的消耗限制了在大规模生产中的使用，

虽然条件温和、具有选择性。细胞悬浮液中加入酶能迅速和细胞壁

反应并破坏它们。酶选择性的催化细胞壁反应，不破坏细胞内的其

它物质。）增溶：利用表面活性剂的增溶作用，将体积为细胞体积2

倍的某浓度的表面活性剂溶液加入到细胞中去，表面活性剂

能将细胞破碎，制成的悬浮液可通过离心分离除去细胞碎片

最典型的是将体积为细胞体积两倍的某浓度的表面活性剂加入

到细胞中。表面活性剂能将细胞壁破碎，制成的悬浮液可用离心分

离除去细胞碎片，再用吸附柱或萃取剂分离制得产品。

（3）脂溶：在细胞悬浮液中加入一定量的有机溶剂，细胞壁脂质层

吸收后，导致胞壁膨胀，最后裂开，细胞质中的物质就释放到周围

溶液中了

（4）碱处理：

碱处理法和酶消化法相反，反应激烈，不具选择性，而且较便

宜。碱加入细胞悬浮液中后和细胞壁进行了多种反应，包括使磷脂

皂化。

（5）机械法

匀浆法

研磨法

超声波法：利用频率高、波长短的超声波进行细胞破碎，效率更

高

球磨破碎法

其它破碎方法

冻结一融化法（亦称冻融法）

干燥法

本章作业

1、简述细胞破碎的意义

2、细胞破碎方法的大致分类

3、渗透压的计算方法

教学后记

生化分离技术

生化系生物学教研室

授课内容第五讲萃取授课时间4学时

教学目的

通过本章学习因掌握以下内容：

1、什么是萃取过程？

2、萃取平衡的条件？

3、液一液萃取的分类？

4、常见物理萃取体系由那些构成要素？

5、何谓萃取的分配系数？其影响因素有哪些？

6、掌握多级萃取萃取级数的计算方法。

7、萃取设备的选择方法

8、何谓超临界流体萃取？其特点有哪些？

9、何谓双水相萃取?常见的双水相构成体系有哪些？

10、反胶团的构成以及反胶团萃取的基本原理

11、反应萃取的基本原理

教学难点

液一液萃取

萃取的分配系数及其影响因素

超临界流体萃取

双水相萃取

反胶团萃取

教学课型新授教学方法讲授法

一、萃取过程

利用在两个互不相溶的液相中各种组分(包括目的产物)溶解

度的不同，从而达到分离的目的

物理萃取、化学萃取

二、物理萃取

利用溶剂对需分离组分有较高的溶解能力，分离过程纯属物理

过程

溶质:被萃取的物质

原溶剂:原先溶解溶质的溶剂

萃取剂:加入的第三组分

萃取剂选择原则：使溶质在萃取相中有最大的溶解度

1、分配系数：衡量萃取体系是否合理的重要参数X/Y

2、萃取分离的基本方程

由物化理论可知：萃取操作达到平衡时，溶质在轻相和重相中的化

〃(/)=〃(〃)

学势相等。即

由上式可知，分配系数的对数值与标准状态下的化学势的差值

k=—=exp[乙-1

xRT

有关

因此，要提高溶质的分配系数，必须提高标准状态下，其在重

相与轻相的化学势之差。

可以采取的方法有：

(a)改变溶剂

(b)改变溶质的特性

•生成有用离子对一一可溶于萃取剂的离子对

将强酸弱碱盐或强碱弱酸盐生成弱酸弱碱盐

•通过改变原溶剂中的pH值，改变溶质的解离

3、单级萃取：使含溶质的溶液(h)和萃取剂(L)解出混合，静

止后分成两层。

4、多级萃取：是工业生产最常用的萃取流程

分离效率高

产品回收率高

溶剂用量少

5、常用的萃取设备

混合一沉降器

旋转圆筒萃取塔

离心萃取器

填充塔

喷雾塔

旋转圆盘塔

三、超临界流体萃取(SupercriticalFluidExtraction,SFE)

1、超临界流体：当一种流体处于其临界点的温度和压力之下，则

称之为超临界流体。特点：

(a)密度接近液体一一萃取能力强

(b)粘度接近气体传质性能好

2、超临界流体萃取的基本思想

利用超临界流体的特殊性质，使其在超临界状态下，与待

分离的物料接触，萃取出目的产物，然后通过降压或升温的方

法，使萃取物得到分离

常用萃取剂：

(1)极性萃取剂：乙醇、甲醇、水(难)

(2)非极性萃取剂：二氧化碳(易)

3、超临界二氧化碳萃取

临界点：

T：304.1P：73.8bar

优点：缺点：

临界条件温和设备投资大

产品分离简单

无毒、无害

不燃

无腐蚀性

价格便宜

超临界C02萃取流程图

thermostat{60匕）

超临界流体的应用

(1)咖啡因萃取

(2)植物油：胚芽油、玉米油、Y亚麻酸

(3)天然香料：杏仁油、柠檬油

(4)啤酒花

(5)尼古丁

四、双水相萃取(AqueousTwoPhase)

1、概念：利用物质在不相溶的，两水相间分配系数的差异进行萃

取的方法

2、可以构成双水相的体系：

(1)离子型高聚物一非离子型高聚物

PEG-DEXTRAN

(2)高聚物一相对低分子量化合物

PEG一硫酸铁

3、双水相萃取的原理

依据悬浮粒子与其周围物质具有的复杂的相互作用：

(a)氢键

(b)电荷力

(c)疏水作用

(d)范德华力

(e)构象效应

4、双水相系统中目标物分配系数的影响因素

(1)成相高聚物浓度一一界面张力

(2)成相高聚物的相对分子量

一般来说，蛋白等高分子量物质易集中于低分子量相

(3)电化学分配

双水相萃取时，蛋白质的分配系数受离子强度的影响很小

(4)疏水反应

(5)生物亲和分配

(6)温度及其它因素

5、双水相萃取的优点

(1)平衡时间短、含水量高、截面张力小，特别适合于生物活性

物质的分离纯化

(2)操作简便

(3)易于放大

五、反胶束萃取(ReversedMicellesExtraction)

胶束是表面活性剂在非极性有机溶剂中形成的一种聚集体

当表面活性剂浓度超过临界微团浓度时，表面活性剂会在水溶

液中形成聚集体

微团和反微团

1、微团：表面活性剂的极性头朝外，疏水的尾部朝内，中间形成

非极性的“核”

2、反微团：表面活性剂的极性头朝内，疏水的尾部向外，中间形

成极性的“核”

3、反微团的优点

(1)极性“水核”具有较强的溶解能力。

(2)生物大分子由于具有较强的极性，可溶解于极性水核中，防

止与外界有机溶剂接触，减少变性作用。

(3)由于“水核”的尺度效应，可以稳定蛋白质的立体结构，增加

其结构的刚性，提高其反应性能。

因此，可作为酶固定化体系，用于水不溶性底物的生物催化

4、构成反胶团的表面活性剂种类

(1)阴离子表面活性剂

AOT

(2)阳离子表面活性剂

季镁盐

六、化学萃取

1、概念：利用可与被萃目标物发生反应的非极性物质作为萃取剂

进行的反应

2、络合萃取分离有机酸(醋酸)

季铁盐

叔胺

3、络合萃取体系构成

萃取剂

稀释剂

离子对(ion-pa瞋N/T+AC~一&N/T•AC~

氢键(H-bonding)

R.N+HACR3N•HAC

离子交换(ionexchange)

本章作业

1、什么是萃取过程？

2、液一液萃取从机理上分析可分为哪两类？

3、常见物理萃取体系由那些构成要素？

4、何谓萃取的分配系数？其影响因素有哪些？

5、何谓超临界流体萃取？其特点有哪些？

6、何谓双水相萃取?常见的双水相构成体系有哪些？

7、反胶团的构成以及反胶团萃取的基本原理

教学后记

生化分离技术

生化系生物学教研室

授课内容第六讲吸附与离子交换授课时间2学时

教学目的

通过本章学习应掌握的问题

1、什么是吸附过程？

2、吸附的类型有哪些？它们是如何划分的？

3、常用的吸附剂种类有哪些？

4、什么是吸附等温线？其意义何在？

5、影响吸附过程的因素有哪些？

6、什么是亲和吸附？其特点有哪些？

7、常用的吸附单元操作有哪些方式？

8、什么是离子交换？

9、离子交换树脂的分类？其主栗的理化性质有哪些？

10、离子交换的机理是什么？

11、什么是离子交换的选择性？其选择性受哪些因素影响？

12、基本的离子交换操作是怎样的？

13、如何利用离子交换法分离蛋白质？

教学重点

吸附过程、亲和吸附、离子交换

教学课型新授教学方法讲授法

一、什么是吸附？(Adsorption)

1、吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的

能力，使其富集在吸附剂表面的过程。

2、吸附过程通常包括：待分离料液与吸附剂混合、吸附质被吸附

到吸附剂表面、料液流出、吸附质解吸回收等四个过程。

二、常见的吸附类型及其主要特点

1、物理吸附：吸附作用力为分子间引力、无选择性、无需高活化

能、吸附层可以是单层，也可以是多层、吸附和解吸附速度通常较

快。

2、化学吸附：吸附作用力为化学键合力，需要高活化能、只能以

单分子层吸附，选择性强、吸附和解吸附速度较慢。

三、常用吸附剂种类

吸附剂通常应具备以下特征：对被分离的物质具有较强的吸附能力、

有较高的吸附选择性、机械强度高、再生容易、性能稳定、价格低廉。

1、活性炭：是非极性吸附剂，因此在水中吸附能力大于有机溶剂中的

吸附能力

针对不同的物质，活性炭的吸附规律遵循以下规律：

(1)对极性基团多的化合物的吸附力大于极性基团少的化合物

（2）对芳香族化合物的吸附能力大于脂肪族化合物；

（3）对相对分子量大的化合物的吸附力大于相对分子量小的化合物；

（4）pH值的影响碱性中性吸附酸性洗脱；

酸性中性吸附碱性洗脱；

（5）温度未平衡前随温度升高而增加；

2、大孔网状吸附剂

特点：脱色去臭效果理想；对有机物具有良好的选择性；物化性质稳

定；机械强度好；吸附速度快；解吸、再生容易。

但价格昂贵，吸附效果易受流速以及溶质浓度等因素的影响。

大孔网状吸附树脂的种类：

（1）非极性吸附树脂：苯乙烯交联而成，交联剂为二乙烯苯，又称芳

香族吸附剂。

（2）中等极性吸附树脂：甲基丙烯酸酯交联而成，交联剂亦为甲基丙

烯酸酯，故又称脂肪族吸附剂。

（3）极性吸附剂：丙烯酰胺或亚飒经聚合而成，通常含有硫氧、酰胺、

氮氧等基团。

吸附机理：

非离子型共聚物，借助于范德华力从溶液中吸附各种有机物，其吸附

能力与树脂的化学结构、物理性能以及与溶质、溶剂的性质有关。通常遵循

以下规律：

（1）非极性吸附剂可从极性溶剂中吸附非极性溶质；

（2）极性吸附剂可从非极性溶剂中吸附极性物质；

（3）中等极性吸附剂兼有以上两种能力

四、吸附等温线

概念：当温度一定时，吸附量与浓度之间的函数关系称为吸附等温线。

Langmuir吸附等温线1

q-K+C

qo和K是经验常数，c代表溶液©

中溶质浓度F

蛋白质分离提纯时适合此吸附方程

四、影响吸附的主要因素

1、吸附剂的性质：比表面积、粒度大小、极性…

2、吸附质的性质：对表面张力的影响，溶解度，极性，相对分子量…

3、温度：吸附是放热过程，吸附质的稳定性

4、溶液pH值：影响吸附质的解离

5、盐浓度：影响复杂，要视具体情况而定

五、亲和吸附

1、亲和吸附分离是利用溶质和吸附剂之间特殊的化学作用，从而实现分

离。

吸附剂由载体和配位体组成

2、亲和吸附的特点

(a)效率高：利用亲和吸附可以从粗提液中一次性分离得到高纯度的

活性物质。

(b)分离精度高：可用于分离含量极低，结构相近的化合物

(C)但通用性较差，洗脱条件苛刻3、影响亲和吸附的因素

(1)配基浓度配基浓度高有利；

(2)空间位阻加入“手臂链”以降低空间位阻的影响；

(3)配基与载体的结合位点就蛋白质等大分子作为配基时，与载体

连接的键越少越好；

(4)载体孔径：孔道大小；

(5)微环境：载体或“手臂链”的极性、电性；

六、离子交换(ionexchange)

1、概念：利用离子交换树脂作为吸附剂，将溶液中的待分离组分，依

据其电荷差异，依靠库仑力吸附在树脂上，然后利用合适的洗脱剂将吸附质

从树脂上洗脱下来，达到分离的目的。

2、离子交换树

脂的构成

(1)具有三维

空间离体结构

的网络骨架

(2)联接在骨

架上的活性基

团

(3)活性基团所带的相反电荷的活性离子(可交换离子)

3、离子交换的分类

按活性基团分类，可分为阳离子交换树脂(cationexchange)(含

酸性基团)和阴离子交换树脂(anionexchange)(含碱性基团)。

具体又可以分为：强阳、弱阳和强阴、弱阴

4、常用的离子交换树脂

(1)强酸性阳离子交换树脂：活性基团是-SO3H(磺酸基)和

-CH2SO3H(次甲基磺酸基)；

(2)弱酸性阳离子交换树脂：活性基团有-COOH,

-OCH2COOH,C6H50H等弱酉史，性基团；

(3)强碱性阴离子交换树脂：活性基团为季铁基团，如三甲胺

基或二甲基羟基乙基胺基；

(4)弱碱性阴离子交换树脂：活性基团为伯胺或仲胺，碱性较

弱；

5、新型离子交换树脂

(1)大孔离子交换树脂

大孔离子交换树脂具有和大孔吸附剂相同的骨架结构，在大孔

吸附剂合成后(加入致孔剂)，再引入化学功能基团，便可得到大

孔离子交换树脂。

(2)多糖基离子交换树脂

固相载体为多糖类物质，亲水性强、交换空间大、对生物大分

子物致变性作用

主要的多糖基离子交换树脂

(a)离子交换纤维素

树脂骨架为纤维素，根据活性基团的性质可分为阳离子交换纤

维素和阴离子交换纤维素两类。

特点：骨架松散、亲水性强、表面积大、交换容量大、吸附力

弱、交换和洗脱条件温和、分辨率高

常用的离子交换纤维素有：

甲基磺酸纤维素、期甲基纤维素(CMC)、二乙基氨基乙基纤

维素(DEAE)(b)葡聚糖凝胶离子交换树脂

骨架为葡聚糖凝胶，如sepharose、sephadex,根据功能基团的

不同，亦可分为阳离子交换和阴离子交换树脂

命名方法：交换活性基团+骨架+原骨架编号

特点：除了具有离子交换功能以外，兼有分子筛的功能，提高

了分离的效率

常用的葡聚糖凝胶离子交换树脂：

CM-sephadexC-25、DEAE-sephadexA-25等

㊀㊉/C2H5

-O-CH-COO-O-C2H5-NH

U2LJC2H5

CzYg*DEAE-Z-J

CM%Ex&yjRF

6、离子交换树脂的理化性能

(1)外观：球形、浅色为宜，粒度大小为16〜60目＞90%；

(2)机械强度：＞90%;

(3)含水量:0.3〜0.7g/g树脂;

(4)交换容量：重量交换容量、体积交换容量、工作交换容量或

称表观交换容量(在某一条件下)；

(5)稳定性：化学稳定性、热稳定性；

(6)膨胀度：交联度、活性基团的性质与数量、活性离子的性质、

介质的性质和浓度、骨架结构；

(7)湿真密度：单位体积湿树脂的重量；

(8)孔度、孔径、比表面积

7、离子交换机理

8、影响交换速度的因素

(1)颗粒大小：愈小越快

(2)交联度：交联度小，交换速度快

(3)温度：越高越快

(4)离子化合价：化合价与高，交换越快

(5)离子大小：越小越快

—A+自溶液中扩散到树脂表面

uA--7^、A+从树脂表面进入树脂内部的活性中心

~A+与RB在活性中心上发生复分解反应

-1於［-解吸附离子B+自树脂内部扩散至树脂表面

B+离子从树脂表面扩散到溶液中

交换速度的控制步骤是扩散速度，不同的分离

体系可能由内部扩散或外部扩散控制

图6.9-18离子交换过程的机理

(6)搅拌速度：在一定程度上，越大越快

(7)溶液浓度：当交换速度为外扩散控制时，

浓度越大，交换速度越快

9、离子交换的选择性

离子交换常数：交换势或交换系数

KB_[R-B][A]S

A[R-阎网,

10、影响离子交换选择性的因素

(1)水合离子半径：半径越小，亲和力越大；

(2)离子化合价：高价离子易于被吸附；

(3)溶液pH:影响交换基团和交换离子的解离程度，但不影响交

换容量；

(4)离子强度：越低越好；

(5)有机溶剂：不利于吸附；

(6)交联度、膨胀度、分子筛：交联度大，膨胀度小，筛分能力

增大；交联度小，膨胀度大，吸附量减少；

(7)树脂与粒子间的辅助力：除静电力以外，还有氢键和范德华

力等辅助力；

11、离子交换操作方法

(1)树脂预处理

物理处理：水洗、过筛，去杂，以获得粒度均匀的树脂颗粒；

化学处理：转型(氢型或钠型)

阳离子树脂酸一碱一酸

阴离子树脂碱—酸—碱

最后以去离子水或缓冲液平衡

(2)离子交换吸附

静态：操作简单、但是分批操作，交换不完全

动态：离子交换柱，操作连续、交换完全，适宜多组份分离

柱式固定床

(3)洗脱

离子交换完成后，将树脂吸附的物质重新转入溶液的方法

洗脱方法

(a)改变溶液pH值

(b)改变溶液离子强度

(4)再生

是指是离子交换树脂重新具有交换能力的过程

酸性阳离子树脂酸-碱-酸-缓冲溶液淋洗

碱性阴离子树脂碱-酸-碱-缓冲溶液淋洗

方式有：顺流再生和逆流再生

七、离子交换应用实例(离子交换法提取蛋白质)

1、蛋白质的结构特点

(1)多肽链

(2)电荷分布不均匀

(3)疏水性

(4)不同的蛋白质具有不同的表面电荷分布

2、pH值对蛋白质荷电情况的影响

3、蛋白质的滴定曲线

不同的蛋白质由于其氨基酸组成的差异，具有不同的等电点

(pl),当溶液(环境)pH值低于其pl时，蛋白质带正电荷，而当

环境pH值高于其等电点时，蛋白质带负电荷，且偏离等电点越多，

其所带电荷越多；

Titrationcurves

+

.gE

o

d」

c

o

Q

p

e

l

lPH

=。

s

o

>

o

■

4、缓冲液pH的选择

离子交换是依据不同蛋白质荷电性质以及大小差异进行分离

的，因此缓冲液的选择将直接影响蛋白质的荷电情况，对于分

离的选择性具有重栗影响。

ControllingselectivitybypH

_u

<D

01

d-

c

o

Q

p

e

q

。

JLL

5、离子交换分离蛋白质的基本步骤

蛋白质的离子交换分离同样要经过：平衡、吸附、洗脱和再生

四个阶段，具体过程如下图所示：

本章作业

1、P223第一题，第二题

2、影响吸附的主要因素？

3、亲和吸附的原理和特点是什么？

4、常用的离子交换树脂类型有哪些？

5、影响离子交换速度的因素有哪些？

6、用于蛋白质提取分离的离子交换剂有哪些哪些特殊要求，主要有哪几类？

教学后记

理论课讲授与实验相结合。

生化分离技术

生化系生物学教研室

授课内容第七讲色谱技术授课时间2学时

教学目的

通过本章学习应掌握的问题

1、什么是色谱分离技术？

2、色谱分离技术的分类？

3、什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算理论塔板数？

4、什么是吸附色谱及其分类和基本原理？

5、什么是分配色谱？

6、离子交换色谱的分类及应用

7、凝胶色谱的分离原理及分类

8、离子交换及疏水作用层析的原理

9、高效液相色谱的分离原理及应用？

10、蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？

教学重点

色谱分离技术

高效液相色谱的分离原理及应用

教学课型新授教学方法讲授法

一■、什么是色谱技术（Chromatography）

概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构

含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行

为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解

吸…），达到分离的目的。

简单的说，色谱技术是在特定的色谱柱当中，利用不同物质

与固定相的亲和力差异而实现分离的一组技术。其优点是分辨率

高，是生化产品纯化、分析的重要手段，这一切均源于其特殊的

分离模式，即塔板理论

二、色谱分离方法的分类

色谱分离方法很多，种类有四、五十种。但常用于生物大分

子分离的色谱方法，按机理分，有以下几种：

1、吸附色谱

2、分配色谱

3、离子交换色谱

4、凝胶色谱

三、色谱分离的基本概念

1、分配系数：可由Langmuir方程得出

足「分配系数

q、c溶质在固相和液相中的浓度

R

2、保留时间（tR）和保留体积（V）:反应样品在柱子中的保留

或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一

•13•

反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间

的关系

理论塔板数的计算方法：

N=5.54(^-YN=1

N--理论塔板数tR保留时间

Wi/2羊峰宽Wb--峰底宽度理论塔板高度:

L--柱长

四、吸附色谱

1、原理：利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力（范德华力，包括

色散力、诱导力、定向力以及氢键）的差异而实现分离

2、关键要素：吸附剂（固定相）和展开剂（流动相）的选择

3、吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原子或

氮原子以及能够形成氢键的基团，如-0H和-NH2

4、常用的吸附剂:

氧化铝、硅胶、活性炭、纤维素、聚酰胺、硅藻土

5、展开剂的选择

展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大

因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的

效果

展开剂选择的原则：

（1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物

质的极性略小

（2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力

6、吸附色谱的操作程序

（1）根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选

择合适的固定相和流动相

（2）吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pH值、流速），进

行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数

（3）洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pH值以及体系离子强度，

最大限度地回收目标产物

五、分配色谱

1、原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离

的方法

2、构成要素：固定相、载体、流动相

载体:通常为惰性材料，能吸附固定相液体

载体种类：

硅胶、硅藻土、纤维素、葡聚糖凝胶

固定相：通常选取各组分溶解度大的溶剂作为固定相

流动相可以是极性的（反相色谱法），也可以是非极性的（正相色

¥）

*反相色谱固定相是非极性的流动相是极性的

3、HPLC（HighPerformanceLiquidChromatography）

是一种典型的分配色谱，它是基于化合物在固定相和流动相

之间分配系数的差异而实现分离的，由于经过了多次的吸附一解

析一吸附的过程，其理论塔板数可高达数万(分析性HPLC)

Injectionvalve

Sintered

metalfrit

Highpressure

pump

Solventreseivoir

4、反相液相色谱

反相液相色谱分离多肽和蛋白质使基于蛋白质的疏水性，因

此通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流

动相的选择应最大限度地满足疏水的要求

载体：微粒多孔硅胶(粒径5um〜20|im)

HypersilSpherosilXOB075

固定相：。8、C8烷基链，C8适于分离蛋白质

C18适于分离核酸

苯基

流动相的选择

通常采用有机溶剂，乙睛、异丙醇、正丙醇和四氢啖喃

六、离子交换色谱

1、概念：以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动

相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法

2、常用的离子交换树脂

(1)葡聚糖凝胶型

DEAE-SephadexA-25,QAE-SephadexA-25,CM-SephadexC-25,

SP-SephadexC-25

(2)纤维素系列离子交换剂

DEAE-SephacelCellex系列

(3)琼脂糖系列离子交换剂

Sepharose系列SepharoseCL-6B,SepharoseFastFlow

Bio-GelA系列交联琼脂糖离子交换剂

(4)Source系列离子交换剂

特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低

阳离子交换树脂S系列

阴离子交换树脂Q系列

(5)MonoBeads系列离子交换剂(Pharmacia)

特点：介质为亲水性聚酉迷，具有和Source系列相同的优点，

但动态载量更大，寿命更长。

同样分为Q系列和P系列

七、分子筛凝胶色谱（GelPenetrationChromatography,GPC）

1、概念：在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经体积的

不同，使不同相对分子量的组分得以分离

2、特点：

操作简便

分离效果好，重复性高，回收率高

分离条件温和

应用广泛适用于生物大分子的初级分离，脱盐

分辨率低

3、分子筛凝胶色谱原理

不同的化合物由于其大小差异，在流经GPC柱时，不同分子

量的化合物流经体积不同（大分子不能或难以进入凝胶网格结构

的内部，直接从凝胶颗粒之间穿过，保留时间短；而小分子恰恰

相反，保留时间较长）而得以分离（如上图所示）

八、疏水作用层析（HydrophobicInteractionChromatography,HIC）

1、原理：依据生物大分子疏水性差异实现分离

由于不同蛋白质分子氨基酸组成差异，其疏水性也不尽相同，

HIC技术是基于生物大分子的疏水性差异而实现分离的，该方法

弥补了HPLC难以用于蛋白质等生物大分子的分离的不足。具体

方法是：

在高盐环境下，蛋白质表面的疏水区域暴露，固定相表面修饰

了一些疏水的基团，这样蛋白质的疏水部分即可与固定相发生较

强的疏水相互作用，从而被结合在固定相表面，而一旦降低流动

相的盐浓度即可实现蛋白质的洗脱（见下图），方便易行，是蛋白

质分离的常用手段之一。

九、亲和色谱(Affinitychromatography)

所谓亲和色谱就是将亲和技术和色谱技术集成得到的一种高

效分离手段，其原理与亲和吸附基本类似，所不同的是经过修饰

的载体颗粒是填充在色谱柱中，以实现连续的色谱分离

载体活化、配基连接、吸附、洗脱

十、蛋白质分离常用的色谱方法

1、免疫亲和层析

属于吸附色谱中的一种，利用抗原-抗体作用的高度专一性以

及较强的吸附力，实现特殊蛋白质的分离

免疫亲和层析介质的获得：

(1)获得抗体

(2)抗体连接到载体上

2、疏水层析

在载体表面连接上疏水的直链碳链或其他疏水基团，如

苯基，可以与蛋白质的某些疏水基团相互作用，从而实现多

组分的分离。

3、离子交换色谱是最常用的蛋白质分离手段

操作要点：

由于蛋白质是两性电解质，在不同的pH值下，其解离

程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以用阴离

子交换，可视具体情况而定

由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通常

采用弱阳或弱阴离子交换剂

适当调节缓冲溶液的pH值，使蛋白质适当解离，通常

采用的pH值靠近其等电点(不是等电点)

缓冲溶液的离子强度不能过高，通常在10〜20mmol

层析方案的确定，需要视试验情况作适当调整

洗脱方式：pH梯度

离子强度梯度___________________________________________

本章作业

1.色谱方法共分几类？常用的蛋白质分离方法有哪些？并简述其原理

2.何为理论塔板高度和理论塔板数？如何计算？

3.简述高效反相液相色谱的工作原理？

4.试分析HPLC和HIC技术的异同

教学后记

生化分离技术

生化系生物学教研室

授课内容第八讲沉析授课时间4学时

教学目的

通过本章学习应掌握的问题

1、什么是沉析？

2、沉析法纯化蛋白质的优点有哪些？

3、沉析的一般操作步骤是什么？

4、何谓盐析？其原理是什么？

5、盐析操作时常用的盐是什么？

6、影响盐析的主要因素有哪些？

7、有机溶剂沉析法的原理是什么？

8、影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？

9、等电点沉析的工作原理是什么？

10、其它常用的沉析方法有哪些？

教学重点

盐析原理

机溶剂沉才听法的原理

教学课型新授教学方法讲授法

一■、何谓沉析？(Precipitation)

利用沉析剂(precipitator)使所需提取的生化物质或杂质在溶

液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。

二、沉析的特点

操作简单、经济、浓缩倍数高，但针对复杂体系而言，分离度不

高、选择性不强

三、分类

盐析、有机溶剂沉析、等电点沉析等

四、沉析操作的一般过程

1、在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂；

2、沉淀物的陈化，促进晶体生长；

3、离心或过滤，收集沉淀物；

五、盐析(Saltinducedprecipitation)

1、概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质(酶)等生物大分子

物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。

2、盐析原理

首先需要了解生物大分子在水溶液中的存在状态：

(1)两性电解质，由于静电力的作用，分子间相互排斥，形成稳

定的分散系

(2)蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰

撞

3、盐析过程

当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：

(1)“盐溶”现象一低盐浓度下，蛋白质溶解度增大

(2)“盐析”现象一