《病原微生物学实验室技术与应用》课件

病原微生物学实验室技术与应用微生物检测技术和安全操作规程课程概述课程目标掌握微生物实验基本技能主要内容微生物检测技术与安全操作学习方法第一章：病原微生物实验室概述基本概念了解病原微生物的定义与特性实验室分级掌握生物安全实验室等级划分安全标准学习生物安全操作规范病原微生物的定义与分类病原微生物定义能引起人、动植物感染和疾病的微小生物细菌与病毒细菌为原核生物，病毒为非细胞型真菌与寄生虫真菌为真核生物，寄生虫体积较大病原微生物实验室的分级四级实验室埃博拉等高致病性病原体三级实验室SARS、炭疽等危险病原体二级实验室一般致病菌如沙门氏菌一级实验室非致病微生物研究实验室生物安全概念生物安全定义防止生物因子对人类、动植物和环境造成危害的措施包括实验室安全操作、废弃物处理和环境保护生物安全重要性保护实验人员健康防止病原体扩散确保实验数据准确维护公共卫生安全第二章：实验室设施与设备基础设施实验室布局与环境控制安全设备生物安全柜与个人防护检测设备显微镜与分析仪器培养设备培养箱与灭菌器实验室基本设施要求实验室布局清洁区与污染区分开通风系统定向气流，负压控制洗手消毒设施非手动水龙头，消毒液生物安全柜Ⅰ级安全柜保护操作者和环境不保护样品1Ⅱ级安全柜保护操作者、环境和样品常用于二级、三级实验室2Ⅲ级安全柜全封闭操作用于高危病原体3使用原则预先紫外消毒操作时减少干扰气流4高压蒸汽灭菌器工作原理121℃高压蒸汽破坏微生物结构操作步骤装载、设置参数、运行、冷却常见问题压力不足、温度偏低、灭菌不彻底解决方法定期维护、使用生物指示剂验证显微镜的使用光学显微镜常规微生物形态观察荧光显微镜特异性标记微生物检测电子显微镜病毒等超微结构观察其他常用设备PCR仪核酸扩增关键设备离心机样品分离处理培养箱微生物培养基础设备第三章：实验室安全操作规程个人防护装备（PPE）防护服一次性隔离衣连体防护服手套乳胶/丁腈手套双层防护口罩与护目镜N95口罩防溅护目镜无菌操作技术洗手消毒操作前彻底洗手器材准备确保所有器材已灭菌安全柜操作在层流条件下进行接种环灼烧红热冷却后使用生物安全柜的正确使用1开启程序开风机→紫外灯消毒30分钟→关紫外灯→工作区消毒2操作中注意动作轻缓→避免阻挡气流→保持工作区清洁3完成后处理清理工作区→表面消毒→紫外灯照射4关闭程序紫外灯消毒结束→关紫外灯→关风机实验室废弃物处理固体废弃物高压灭菌后焚烧双层生物安全袋密封专人专车运送液体废弃物含氯消毒剂处理作用30分钟以上专用下水道排放尖锐物品专用硬质容器收集不过满，密封牢固高温高压处理实验室事故应急处理事故类型识别泄漏、溅出、暴露、火灾人员撤离保持冷静，按指定路线撤离污染控制使用消毒剂覆盖污染区报告记录详细记录事件过程与处理方法第四章：基础实验技术微生物培养基制备1培养基种类选择根据微生物生长需求选择2成分称量配制精确计量各组分3pH调整与灭菌高压灭菌121℃15-20分钟4质量控制检查无菌性、支持力测试接种技术平板划线法分离纯化单菌落倾注平板法测定细菌数量液体培养接种大量培养微生物染色技术革兰氏染色区分革兰阳性和阴性细菌抗酸染色结核分枝杆菌等检测荧光染色特异性高，荧光显微镜观察镜检技术湿片法观察活体微生物运动操作简便，不需固定染色悬滴法长时间观察微生物活动避免细菌干燥和死亡油镜观察高倍率细节观察需使用浸油增加分辨率细菌计数方法30-300平板计数法适宜计数范围内菌落3最可能数法稀释度设置，统计阳性管数0.1比浊法麦氏比浊管比较或分光光度计第五章：病原细菌检测技术分离培养获取纯培养物生化鉴定确定细菌种类血清学检测抗原抗体反应分子生物学检测核酸特异性识别药敏试验确定药物敏感性细菌分离培养选择性培养基抑制非目标菌生长鉴别培养基不同菌种呈现不同颜色富集培养基促进目标菌快速生长细菌生化鉴定API系统多种生化试验条带根据颜色变化判读用于临床常见细菌自动化鉴定系统VITEK、Phoenix系统计算机辅助判读快速出结果质谱鉴定技术MALDI-TOFMS蛋白质指纹图谱精确度高，速度快血清学检测凝集试验抗原抗体形成可见凝集物常用于细菌菌株血清型鉴定ELISA试验酶联免疫吸附实验可定性或定量检测抗原抗体免疫荧光技术特异性荧光抗体标记直接或间接法检测分子生物学检测常规PCR扩增特定基因片段实时荧光定量PCR边扩增边检测，可定量基因芯片技术高通量多重检测药敏试验纸片扩散法测量抑菌圈判断敏感性微量稀释法确定最低抑菌浓度E-test方法梯度扩散技术，简便准确第六章：病毒检测技术1分子检测特异性高，敏感度高2抗原检测快速，适合现场使用3病毒分离培养金标准，可获活病毒病毒培养技术细胞培养观察细胞病变效应鸡胚培养流感病毒等培养方法动物接种观察临床症状与病理变化病毒分离与鉴定1细胞病变观察细胞融合、变圆、脱落2血凝试验流感、麻疹等病毒鉴定3中和试验特异性抗体阻断病毒感染病毒抗原检测免疫荧光法荧光标记抗体直接或间接法需要荧光显微镜ELISA法酶联免疫吸附试验高通量筛查定性或定量检测胶体金快速检测侧向层析技术10-30分钟出结果适合现场快速检测病毒核酸检测样本处理提取病毒RNA/DNART-PCRRNA病毒需逆转录为cDNA实时荧光PCR定量检测病毒载量基因测序病毒溯源和变异分析血清学诊断时间（天）IgM抗体IgG抗体IgM抗体检测用于急性感染，IgG抗体检测反映既往感染或免疫状态第七章：真菌检测技术形态学鉴定菌落特征和显微结构培养与生化试验特殊培养基和代谢特性血清学检测抗原抗体反应特异性识别分子生物学检测核酸扩增和基因测序真菌培养与鉴定培养基选择沙氏培养基、马铃薯葡萄糖琼脂形态学鉴定菌落颜色、质地、生长速度显微形态观察菌丝、孢子形态结构生理生化试验碳源利用、尿素水解等真菌显微镜检查直接镜检KOH清除背景，显示真菌结构悬滴法观察真菌生长和形态发育透明胶带法保留真菌孢子自然排列方式真菌血清学检测抗原检测隐球菌荚膜多糖抗原侵袭性曲霉菌半乳甘露聚糖侵袭性念珠菌甘露聚糖抗体检测组织胞浆菌抗体球孢子菌抗体肺孢子菌抗体1,3-β-D葡聚糖检测真菌细胞壁成分侵袭性真菌感染标志物不能区分真菌种类真菌分子生物学检测DNA提取破壁关键步骤1PCR扩增ITS区域常用靶标2荧光原位杂交特异性识别真菌3基因测序精确鉴定菌种4第八章：寄生虫检测技术粪便检查技术直接涂片法简便快速，活动性观察浮聚法密度小的虫卵浮于液面沉淀法密度大的虫卵沉于底部血液寄生虫检查厚膜法检出率高适合低密度感染形态识别难度大薄膜法形态清晰种类鉴定准确检出率低于厚膜法集中法离心或过滤富集提高检出率适合丝虫等检查组织寄生虫检查皮肤刮片法疥虫、利什曼原虫检查患处边缘刮取，显微镜观察组织压片法囊虫、旋毛虫检查组织压片透明化后观察消化法人工胃液消化组织释放囊内幼虫便于观察寄生虫免疫学检测免疫荧光法特异性高，操作复杂ELISA法高通量，适合大规模筛查免疫层析法快速简便，现场检测寄生虫分子生物学检测1PCR技术高敏感性，种属特异性识别2LAMP技术恒温扩增，无需热循环仪基因芯片技术多种寄生虫同时检测第九章：新型检测技术1质谱技术快速鉴定微生物种类2基因组学全基因组测序与宏基因组分析3蛋白质组学蛋白表达谱与功能研究4生物芯片高通量多靶点检测5纳米技术纳米颗粒与生物传感器应用质谱技术在微生物检测中的应用MALDI-TOFMS原理基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱微生物蛋白质指纹图谱比对频谱峰图特征识别优势鉴定速度快（分钟级）操作简便，成本低准确率高（＞95%）广泛适用各类微生物基因组学技术应用价值病原体精准鉴定与分型2宏基因组分析复杂样本中直接检测病原体全基因组测序测定完整基因组序列蛋白质组学技术双向电泳分离复杂蛋白质混合物液相色谱-质谱联用高灵敏度蛋白质鉴定病原体研究应用毒力因子与抗药性研究疫苗与诊断开发发现新型诊断标志物生物芯片技术DNA芯片多种病原体同时检测蛋白质芯片抗原抗体相互作用分析微流控芯片样本处理与检测一体化纳米技术在病原体检测中的应用纳米颗粒增强检测信号纳米生物传感器超高灵敏度检测纳米药物递送靶向治疗感染应用前景现场快速诊断第十章：实验室质量控制质量管理体系ISO标准与认证内部质量控制日常操作监控与评估外部质量评价能力验证与实验室间比对生物安全管理风险评估与应急预案实验室质量管理体系1质量改进持续改进与优化质量控制与评价监测评估质量指标标准操作程序统一规范操作流程质量手册体系文件与政策ISO15189标准医学实验室质量与能力内部质量控制日期质控值上限下限第6天质控值超出上限，需要检查原因并纠正外部质量评价接收能力验证样品未知样本检测挑战常规方法检测按日常程序操作提交结果报告规定时间内完成结果分析与改进对比其他实验室结果生物安全管理1风险评估微生物危害等级评估2安全操作规程标准防护