《化妆品原料及产品中胶原蛋白含量的测定 圆二色光谱法》（征求意见稿）

化妆品原料及产品中胶原蛋白含量的测定圆二色光谱法本文件规定了使用圆二色光谱法测定化妆品原料及产品中胶原蛋白含量的方法。本文件适用于以动物皮肤、骨骼等组织为原料，经脱脂、酶法处理和精制等工艺获得的以胶原蛋白为主要成分的化妆品原料及产品。注：有三螺旋结构的重组胶原蛋白的检测可以参考本文件。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T27417合格评定化学分析方法确认和验证指南YY/TXXX组织工程医疗器械胶原蛋白JY/T0572圆二色光谱分析方法通则《中华人民共和国药典》2020版四部3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1胶原蛋白一类含有至少28种在遗传学上不同类型的分泌蛋白质家族，主要担任机体的结构支撑功能，具有独特的由三条多肽链（被称为α链）组成的三螺旋结构，并具有一定的生物学功能。3.2三螺旋结构构成胶原蛋白的三条多肽链以右手螺旋的形式构成螺旋结构，其中每一条肽链均为左手螺旋构4原理利用胶原分子中具有光学活性的基团对平面圆偏振光吸收的差异，可以测定溶液状态下胶原的构象。由于天然胶原具有三螺旋结构，胶原的圆二色光谱（CD光谱）图在221nm左右的波长处有正峰，在195nm左右的波长处有负峰，正吸收峰是胶原三螺旋构型的圆二色谱典型特征，可以作为胶原三螺旋结构有无的定性判定指标。加上负峰位置，说明胶原的三螺旋结构完整性。通过采用不同浓度具有完整三螺旋结构的胶原对照，制备系列不同三螺旋结构含量的标准样品，测定其221nm处的峰高，获得定量标准曲线，用于供试品胶原蛋白相对含量的计算。5材料5试剂和材料5.1冰醋酸，色谱纯；5.2胶原蛋白对照品（建议使用I型胶原蛋白国家有证标准样品）；5.3比色皿，选择干净、无裂纹、划痕和斑点、透光率高的比色皿；5.4氮气，按仪器要求选择纯度≤99.99%的氮气进行吹扫。6仪器和设备6.1分析天平，十万分之一；6.2离心机，转速转速10000r/min；6.3圆二色光谱仪。7检测方法7.1待测样品制备称取5mg胶原蛋白供试品，加入0.5%醋酸溶液，置于10mL容量瓶中，定容至10mL，混合均匀，配制成浓度为0.5mg/mL胶原溶液，10000r/min离心5min，取上清液备用。注：液体样品参考终体积浓度为0.5mg/mL胶原溶液制备。7.2胶原蛋白对照品梯度溶液制备称取5mg胶原蛋白对照品，加入0.5%醋酸溶液，置于10ml容量瓶中，定容至10ml，摇晃均匀，配制成浓度为0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL的胶原梯度溶液。7.3检测条件取配制后的胶原蛋白对照品/供试品溶液，加入石英比色皿，置于CD光谱仪上进行检测，使用0.5%醋酸溶液作为参比。供试品均平行测定三次，取平均值。样品池光径：1mm；扫描范围：180nm～260nm；扫描波长：0.1nm；扫描速度：120nm/min。7.4准确度和精密度要求线性R值≥0.95；精密度：用相对标准偏差表示，RSD≤1%。7.5标准曲线制作测定胶原蛋白对照品梯度溶液在221nm处的峰高，以峰高为纵坐标，胶原蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算出回归方程和相关系数（1用标准工作曲线对样品进行定量。Y=ac+b,R2(1)式中：C——胶原蛋白浓度；Y——221nm处的峰高；a——常数；R2——相关系数。7.6数据处理用仪器自带软件导出带有实验记录数据的Excel文件，并用Origin软件对实验数据做图形化处理，得到横坐标为221nm处对应的纵坐标数值（峰高）。8实验结果及分析8.1定性分析a)在221nm～222nm出现正峰，在195nm～200nm出现负峰，且绝对值的比值处于0.09～0.15之间,则判定供试品有三螺旋结构。b)在221nm处未检测出正峰，表明供试品没有三螺旋结构。8.2定量分析将按7.1步骤制备的待测样品溶液在7.3条件下测试后，将样品在221nm处的峰高的代入标准曲线(1)进行计算，即得到供试品中胶原蛋白的浓度。供试品中胶原蛋白含量按式（2）进行计算。(1)式中：X——试样中胶原蛋白的百分含量，%；