《植物组织培养》课件 模块三-2 无菌操作技术

项目三

无菌操作技术任务三外植体的选择与处理任务二无菌操作技术任务一虚拟无菌操作任务二无菌操作技术知识目标理解有菌和无菌的范畴；掌握常用的灭菌方法；掌握无菌操作过程。

123掌握组织培养相关的灭菌方法；熟练掌握无菌操作技术；12

灭菌和接种

任务讲解灭菌和接种一、灭菌二、无菌操作三、接种第一节灭菌和接种

灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。无菌室等未经处理的地方、超净台表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。灭菌和接种第一节灭菌和接种

这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。茵的特点是：极小，肉眼看不见。无处不在，无时不有，无孔不人。在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。灭菌和接种第一节灭菌和接种

无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体(当然这些方法必须已经证明是有效的)，高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的。灭菌和接种第一节灭菌和接种消毒：杀死、消除或抑制部分微生物，使之不发生作用。灭菌：用物理或化学方法，杀死物体表面和孔隙内一切微生物或生物体，即所有生命的物质全部杀死。灭菌和消毒的区别是什么？一、灭菌灭菌和接种灭菌概念1.培养基灭菌◆高压湿热灭菌◆某些激素、维生素采用过滤灭菌视频3-1培养基灭菌自动高压湿热灭菌锅1电源水位指示灯温度、压力显示窗温度压力设置钮压力表放汽阀灭菌锅1卧式灭菌锅2卧式灭菌锅2卧式灭菌锅结构

过滤灭菌滤膜Ø0.45um以下1.过滤器先灭菌，灭菌温度不超过121℃。2.溶液先进行初滤(滤膜Ø0.65um)过滤灭菌

培养基高压蒸汽灭菌所必需的最少时间容器体积(mL)121℃灭菌所需最少时间(min)20-501575-15020250-50025100030高压蒸汽灭菌2.玻璃器皿灭菌◆干热灭菌：160-180℃,1.5-2.0h◆湿热灭菌：121℃,20-40min◆接种前用酒精棉球擦试，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。3.接种工具灭菌◆用前干热灭菌：160～180℃,1.5～2.0h◆用前湿热灭菌：121℃,20～30min◆接种前用酒精棉球擦试，浸入95%酒精液中，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。◆湿热灭菌：121℃，20～30min◆实验服灭菌后置于缓冲间或密封好。4.实验服、口罩、滤纸灭菌4.实验服、口罩、滤纸灭菌5.接种室灭菌紫外灯照射(接种室、超净台、接种箱)：波长260nm，距离小于1.2m，15～20min。臭氧灭菌机：1～2h熏蒸灭菌：2ml/m3甲醛+0.2g/m3

高锰酸钾；冰醋酸；1～3%高锰酸钾或3%来苏儿。

接种台喷雾消毒：75%酒精。

◆用化学灭菌剂消毒◆常用化学灭菌剂6.接种材料灭菌视频3-2

接种材料灭菌水洗茎尖选取酒精灭菌氯化汞灭菌无菌水冲洗接种灭菌图示常用灭菌剂的使用浓度与效果比较灭菌剂使用浓度持续时间去除难易效果次氯酸钙9-10%5-30min易很好次氯酸钠2%5-30min易很好氯化汞0.1-1%5-8min较难最好抗菌素4-50mg/L30-60min中较好灭菌剂的使用浓度与效果8.培养室灭菌新建培养室用前一定要彻底熏蒸1次；隔2-5天用洗衣粉水或来苏水拖地1次，用高锰酸钾擦架1次。

熏蒸灭菌：

2ml/m3甲醛+0.2g/m3

高锰酸钾二、无菌操作

接种时由于有一个敞口的过程，所以是极易引起污染的时期，这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起，接种室要严格进行空间消毒。接种室内保持定期用1%～3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行擦洗。视频3-3无菌操作

除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外，还可在使用期间用70%的酒精或3%的来苏儿喷雾，使空气中灰尘颗粒沉降下来。无菌操作可按以下步骤进行：(1)在接种4h前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外灯进行灭菌；(2)在接种前20min，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯；(3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；(4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后擦拭工作台面；(5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；(6)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；(7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。注：若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。三、接种三、接种三、接种灭菌和无菌操作是组织培养的关键，在各环节中都要保持无菌的环境；灭菌的方法很多，要根据材料和目的来选择