利用同源重组构建基因表达载体与融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用酵母双杂交系统与免疫共沉淀课件

利用同源重组构建基因表达载体与融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用酵母双杂交系统与免疫共沉淀突破1

利用同源重组构建基因表达载体(2023·江苏卷，22)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有__________，扩增程序中最主要的不同是________。模板、引物退火温度(2)有关基因序列如图2。引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用________。A.ATGGTG——CAACCAB.TGGTTG——CACCATC.GACGAG——CTGCAGD.CTGCAG——CTCGTCCD(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有___________________________________。(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有________。A.稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化限制性内切核酸酶、DNA连接酶ABC(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是_________________________________________________________________________________________________。P3、P4电泳只能显示扩增片段的大致长度，不能显示精准的DNA碱基数量。也不能呈现DNA碱基序列角度1无缝克隆技术In－Fusion技术，即无缝克隆和组装技术，是一种新型的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。具体原理是：在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In－Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。命题要点：(1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。(2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。[例1]

(2024·广东佛山调研)纤维素是自然界中分布最广、含量最丰富的一种多糖，水解纤维素的酶系包括内切酶(EG)、外切酶(CBH)和B－葡萄糖苷酶(BGL)。已知酿酒酵母菌不能吸收纤维素，科研人员利用基因工程技术依次将EG基因、CBH基因和BGL基因分多步导入酿酒酵母菌，获取可以直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌。(1)科研人员常用PCR技术获取和扩增EG基因、CBH基因和BGL基因，该过程不需要添加解旋酶，但DNA也能解旋的原因是_____________________________。若PCR产物中出现了部分非目标序列，可能的原因有_________________________________________________________________________________(答出两点即可)。高温也可使氢键断裂，双链打开

引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性；复性温度过低，DNA聚合酶的质量不好等(2)构建基因表达载体是基因工程的核心步骤，科研人员采用以下两种方法构建含有EG基因的表达载体。①双酶切法：如图甲标注了载体、EG基因的限制酶切点、EG基因插入部位及两端的部分序列，已知酿酒酵母菌不能合成尿嘧啶，图中的标记基因为尿嘧啶合成基因。结合图中信息分析，在扩增EG基因时应在引物的________(填“5′”或“3′”)端添加__________________限制酶的识别序列，设计的引物序列为_________________________________________。(从5′端书写，写出前12个碱基序列即可)5′BamHⅠ、SacⅠGGATCCGAATCG、GAGCTCAGCCTA②同源重组法：该操作可通过PCR技术在任一位点实现质粒的线性化，只要将目的基因两端带有与线性化质粒两端同源的DNA序列，在相关酶的作用下即可实现质粒上的同源重组(如图乙所示)。与双酶切法相比，同源重组法构建基因表达载体的突出优点是___________________________________________________________。在相关酶的作用下可以实现载体上任一点与目的基因的重组(3)导入上述重组质粒的酿酒酵母菌应在___________的培养基上筛选培养。将筛选得到的菌株接种到液体培养基中培养一段时间，通过检测__________，以确定其发酵效果。不含尿嘧啶酒精的含量角度2

Cre/LoxP重组酶系统Cre/LoxP重组酶系统的核心元件：(1)Cre重组酶：由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。(2)LoxP序列：来源于P1噬菌体，包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向，LoxP有不同“亚型”，可以嵌套使用。命题要点：(1)同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。(2)反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。(3)依赖于Cre基因的表达：在目的基因上游，放置一个带有LoxP位点的终止密码子，可以防止Cre基因缺失时的表达。在Cre基因存在的情况下，终止密码子被切除，基因表达继续进行。[例2]Cre/LoxP重组酶系统是对转基因受体细胞DNA上的特定序列进行定点切割和重新连接，从而在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术。请回答下列问题：(1)LoxP具有方向性，结构如图一所示，其中决定方向的序列是________(填序号)。Cre酶能随机识别DNA分子上的两个相同的LoxP序列，并在其中的特定位点切断DNA双链，重新连接切口后，连接时形成的化学键是____________，两个同向LoxP在发挥作用时，机制如图二，则保留图二中片段________(填序号)，就能实现目标基因的敲除。②磷酸二酯键2(2)Cre/LoxP重组酶系统可以调控基因的表达，在目的基因________(填“上游”或“下游”)插入一个带有LoxP位点的编码终止密码子的序列，在Cre酶存在的情况下，目的基因________(填“表达”或“不表达”)。若经Cre酶作用使得2个LoxP位点间的序列发生反转，其原因可能是______________________________。上游表达两个LoxP序列相反(3)“脑彩虹”是一项最新的大脑成像技术，通过荧光蛋白“点亮”大脑内的神经元，帮助科学家了解大脑。①研究者设计如图所示的DNA片段。已知三种荧光蛋白的氨基酸序列，则可通过________________法获得相关基因，再利用限制酶和____________酶将三种荧光蛋白基因和两种LoxP序列、启动子M与载体连接，形成重组质粒，采用____________法将其导入小鼠的受精卵细胞中，经过筛选、培育，获得转基因小鼠。人工化学合成DNA连接显微注射②在Cre酶的帮助下，一些荧光蛋白基因可能会被随机“剪掉”，但两个LoxP1或两个LoxP2之间的基因，最多会被Cre酶敲除一次，Cre酶基因在环境中存在化学物质Tam时才能激活表达，因此该小鼠“脑彩虹”的出现可受Tam的调控：a.若无Tam作用时，该小鼠脑组织的色彩为________色，其他组织细胞颜色为________色。b.若有Tam作用时，该小鼠脑组织会出现“脑彩虹”，请阐述机理：______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。红无若有Tam作用时，则启动Cre酶基因的表达，在该酶的作用下，一些荧光蛋白基因可能会被随机“剪掉”，若随机敲除两个LoxP1之间的红色荧光蛋白基因，此时细胞为黄色，敲除两个LoxP2之间的红色和黄色荧光蛋白基因，此时细胞为蓝色，也有可能未成功敲除荧光蛋白基因，此时细胞为红色，这样就会出现不同脑细胞差异表达红色、黄色或蓝色荧光蛋白基因，进而出现“脑彩虹”突破2

融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用1.(2023·辽宁卷，8)CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起(如图)，使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去(

)A.CD163基因中编码起始密码子的序列B.CD163基因中编码终止密码子的序列C.RFP基因中编码起始密码子的序列D.RFP基因中编码终止密码子的序列B2.(2023·浙江6月选考，19)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3－GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。B下列叙述正确的是(

)A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3－GFP基因纯合子D.若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子1.融合基因与融合蛋白 (1)融合基因：是指将两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套启动子和终止子内部构成的嵌合基因。启动子基因1基因2基因3终止子(2)融合蛋白：是指融合基因的表达产物。(3)启动子及其类型启动子是一段具有特殊序列结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。主要包括以下三种类型：①组成型启动子：能够调控基因表达，使其基本恒定在一定程度上，从而使基因在不同部位或组织中的表达水平不存在明显差异。这类启动子一般来自管家基因，可连续不断地启动基因的表达。②组织特异性启动子：其调控作用使得基因往往只在某些特定器官或组织中表达，且表现出发育调节的特性。如构建乳腺生物反应器时所用的在乳腺中特异表达的基因的启动子。③诱导型启动子：即在某些特定的物理或化学信号刺激后，使目的基因的转录水平有所提高。2.融合基因的种类(1)目的基因＋报告/标记基因其主要目的是对目的基因进行示踪，研究其功能及特性。标记基因有绿色荧光蛋白基因(GFP基因)、β－半乳糖苷酶基因(LacZ基因)、β－葡萄糖苷酸酶基因(GUS基因)、虫荧光素酶基因(Luciferasese基因)等。启动子目的基因绿色荧光蛋白基因终止子(1)报告/标记基因一般连在目的基因的下游，这样才能确信表达了标记基因的受体细胞也表达了目的基因，即受体细胞出现绿色荧光，说明目的基因已经表达。如果报告/标记基因在前，目的基因在后，有可能受体细胞只成功表达报告/标记基因，而未成功表达目的基因。(2)编码信号肽或单体蛋白序列的基因＋目的基因其主要目的是利用信号肽或单体序列携带目的基因高效表达，从而提取纯化目的蛋白，为生产或科研所用。(3)功能基因＋功能基因分为两类：一是相同功能基因的融合(目的是增强基因的功能，扩大基因的应用范围，例如杀虫基因之间的融合)；二是不同功能基因的融合(为特殊需要而构建，例如将编码大肠杆菌热不稳定性毒素B亚单位基因EtxB与肿瘤抗原基因连接，制成一种融合基因肿瘤疫苗。肿瘤抗原的免疫原性弱，而细菌抗原EtxB的免疫原性强，免疫系统对细菌抗原会产生很强的免疫应答反应，而在反应中被激活的针对细菌抗原的CD4Th免疫细胞可通过链接产生针对肿瘤抗原的体液免疫和细胞免疫，从而高效增强肿瘤疫苗的效力)。[例1]

(2024·南通高三质检)OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接，构建多基因表达载体(载体中部分序列如下图所示)，利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述正确的是(

)A.四个基因转录时都以DNA的同一条单链为模板B.四个基因都在水稻叶绿体内进行转录、翻译C.应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞D.可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达情况D[例2]

(2024·北京海淀区高三上学期期末节选)(2)热纤梭菌中Co和Do蛋白能以高亲和力相互作用，形成复合物。科研人员将Cas9蛋白的N端和C端两个片段分别与Co和Do蛋白融合，构建Cas9(N)－Co复合物和Cas9(C)－Do复合物，这两个复合物在细胞中相遇时，Cas9可恢复全酶活性，科研人员构建图1所示的表达载体，导入受体细胞。启动子1为远红光诱导型启动子，启动子2为持续表达启动子。据此分析，在没有远红光照射时，受体细胞中Cas9(N)、Cas9(C)和Cas9蛋白的存在状态及位置是_____________________________________。无Cas9(N)和Cas9，Cas9(C)存在于细胞质与持续表达Cas9全酶相比，上述方法的优势是__________________________________________________________________________________________________。

仅在远红光诱导时才有全酶进入细胞核，可减少Cas9全酶长时间在细胞核中对非目标DNA的切割3.获得融合基因的方法——以重叠延伸PCR技术为例以融合基因M和基因N为例，步骤是：(1)设计4种引物：引物1和引物4为普通引物。引物2的3′端含有基因M的序列，5′端含有基因N的序列；引物3的3′端含有基因N的序列，5′端含有基因M的序列；引物2和引物3完全互补配对。(2)PCR扩增：利用引物1和引物2扩增基因M，2轮循环可得到M′型DNA分子；利用引物3和引物4扩增基因N，2轮循环可得到N′型DNA分子。(3)获得融合基因M＋N：将M′型DNA分子和N′型DNA分子放在同一个PCR管里，变性、复性、延伸后，就得到了拼接好的融合基因M＋N。[例3]

(2024·江西南昌质检)透明颤菌血红蛋白基因vgb表达产物VHb蛋白能使其在低氧的环境中生长良好。顶头孢霉是好氧型真菌，其发酵产物头孢菌素C有很大的市场需求量，但低氧环境影响其产量，传统发酵生产的增氧成本高。为提高产量科研人员将透明颤菌血红蛋白基因vgb基因和顶头孢霉pcpC启动子进行PCR拼接，并与质粒1构建重组质粒，如下图。注：hph是潮霉素抗性基因，Vgb基因与hph基因共用终止子。回答下列问题：(1)PCR过程除了需要引物外，还需要的条件有________________________________________________________(写三点)。pcpC启动子是____________识别和结合的部位。(2)据图所示，重叠延伸PCR拼接时，若启动子启动方向与引物3延伸方向一致，引物2和引物3的5′端需分别添加_______________的酶切位点。拼接形成重组基因的目的是_________________________________________________________________________。DNA模板、四种游离的脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶RNA聚合酶XbaⅠ、BamHⅠ使顶头孢霉在低氧的环境中生长良好，提高其发酵产物头孢菌素C的产量(3)利用含有____________的选择培养基初步筛选菌种；最后从个体生物学水平上鉴定，若在低氧环境下，检测到头孢菌素C表达量________，则表示转化成功。潮霉素增多4.融合蛋白的分离(1)融合蛋白存在的问题如果二者翻译成一条多肽链，有可能影响彼此的折叠和空间结构，进而影响彼此的生物学活性；如果二者翻译成一条多肽链，有可能影响彼此的亚细胞定位。目的蛋白不能正确的进入它正常要去的场所，导致不能正常的发挥生物学功能。(2)融合蛋白分离措施①使用2A序列：2A序列是一对来源于病毒的短肽(18～25个氨基酸)，通常被称为“自我剪切肽”，能使一条转录产物产生多种蛋白，其原理如图：②使用“IRES序列”：“IRES”是内部核糖体进入位点序列，能招募核糖体对mRNA进行翻译，使用单个启动子启动多个基因表达时，可以将多个基因通过IRES序列分隔开，一条mRNA就会翻译成多条多肽链，其原理如图：[例4]

(2024·江苏南通一模)通常真核细胞翻译的起始必须依赖于mRNA的5′端帽子结构，而内部核糖体进入位点(IRES)则是位于mRNA内部的核糖体识别、结合序列，IRES使翻译可以从mRNA内部开始。人溶菌酶和人乳铁蛋白是人乳中重要的抗菌蛋白，科研人员构建人溶菌酶基因(hLYZ)和人乳铁蛋白基因(hLTF)双基因表达载体，并获得转基因牛胚胎。如图表示双基因表达载体的主要构建过程，请回答下列问题。限制酶识别序列：BamHⅠ：G↓GATCCNheⅠ：G↓CTAGCXbaⅠ：T↓CTAGA相关结构：Ori：复制原点AmpR：氨苄青霉素抗性基因NeoR：新霉素抗性基因(1)IRES的基本组成单位是__________，翻译时核糖体在mRNA移动的方向是________(填“5′→3′”或“3′→5′”)。与两个基因直接连接形成融合基因相比，两个基因之间插入IRES序列的意义是_____________________________________________________________________。核糖核苷酸5′→3′便于得到两种具有功能的蛋白质(一种mRNA可翻译形成两种蛋白质)(2)为实现hLTF与IRES序列的连接，在PCR扩增基因片段时通常在引物的5′端添加特定的限制酶识别序列，而不在3′端添加的原因是__________________________________________________________________。(3)过程①中，用_________________切割质粒a、b后，再用________(方法)分离，收集质粒a的hLTF片段，与质粒b的大片段连接，获得重组质粒1。使引物的3′端与模板链严格互补配对，保证子链的延伸XbaⅠ和NheⅠ电泳法(4)过程②中，用BamHⅠ分别处理重组质粒1和质粒c，再连接形成的重组质粒不止一种，这是因为___________________________________________________________________。用BamHⅠ对重组质粒2进行酶切，获得的DNA片段大小为_______________________。

目的基因与质粒c存在正反连接、目的基因多拷贝与质粒c连接等3.2kb和8.2kb(5)科研人员以包含重组质粒2的脂质体转染乳腺上皮细胞时，在细胞培养液中加入一定浓度的新霉素的主要目的是______________________________________。选择乳腺上皮细胞作为受体细胞便于检测______________________________________。便于筛选导入重组质粒2的牛乳腺上皮细胞hLYZ和hLTF(目的基因)能否表达(6)研究人员试图以转hLYZ与hLTF的奶牛乳腺上皮细胞作为供体细胞，培养转基因克隆胚胎，在此过程中主要涉及的现代生物技术有________________________________________________________________________________________________________(答出两条即可)。体细胞核移植技术、早期胚胎培养技术(动物细胞培养技术、卵母细胞采集与培养技术)突破3

酵母双杂交系统与免疫共沉淀(2022·山东卷，25)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是__________________________________________________________，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸5′端(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是_________________________________________________________________________________________________________________________。P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是_________________________________________________________________。图甲在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG－P、FLAG－P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG－P和FLAG－P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是______________________________________________________________；增强FLAG－P与UBC的结合由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是______________________。(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是_________________________________________________________________。参与P与UBC的结合药物A通过增强P与UBC结合，促进P降解角度1酵母双杂交系统1.酵母菌的转录激活因子含有两个不同的结构域：DNA结合结构域(BD)和DNA转录激活结构域(AD)，这两个结构域可以独立分开，功能互不影响。2.BD和AD分别单独作用并不能激活转录反应，只有当二者在空间上充分接近时，才呈现完整的转录激活因子活性，使下游基因得到转录，可将两个待研究蛋白(蛋白X与蛋白Y)分别与BD、AD结构域构建质粒来探究其是否具有相互作用，如果X与Y不存在相互作用，则下游基因不会表达；如果X与Y存在相互作用，则下游基因表达。(如图所示)命题要点提醒：(1)一般不将BD－X与AD－Y两融合蛋白构建在同一质粒上，而是将BD－X与AD－Y构建在两个质粒上，然后共转染到同一酵母细胞。(2)下游常用荧光蛋白基因作为报告基因来验证X与Y是否有相互作用。(3)融合基因的构建：如想要把两基因(CD163与RFP)融合并成功表达出对应的融合蛋白，要将上游基因即靠近启动子的基因(CD163)中编码终止密码子的序列去除，这样才不会使得在融合蛋白表达过程中翻译完CD163后终止。[例1]

蛋白质甲基化是最广泛的翻译后修饰之一，组蛋白甲基转移酶G9a主要修饰蛋白质中赖氨酸、精氨酸，从而调控基因表达。酵母细胞基因转录因子BD(含赖氨酸)和AD两结构域结合时才能激活转录，两结构域分开时不能激活转录，为了筛选赖氨酸甲基化阅读器(只有甲基化的赖氨酸才能被“阅读器”识别)，研究人员进行了如图1所示实验，其中TRP1、LEU2分别是色氨酸、亮氨酸合成基因，G9a基因表达产物(含G9a)能与BD基因表达产物结合，当赖氨酸甲基化阅读器与G9a、BD复合体相互作用后，BD就可以与AD一起激活报告基因LacZ转录，如图2。请回答下列问题。(1)组蛋白甲基化影响基因表达水平，并可遗传给后代，这种现象________(填“属于”或“不属于”)基因突变，________(填“会”或“不会”)遗传给后代。(2)为了使“阅读器”基因定向插入载体中，通过PCR技术扩增“阅读器”基因时，需在引物5′端添加______________________________________序列。不属于会GAATTC、GGATCC(3)质粒甲、乙导入代谢缺陷型酵母菌时，需用氯化钙(CaCl2)处理酵母菌，其目的是____________________________________________________________________________________。两培养基中需分别不添加________________才可筛选出导入重组质粒的酵母菌。转化后需要在相应的培养基上培养和筛选，选择导入了__________________________________________(填“融合表达载体”“报告基因载体”或“融合表达载体和报告基因载体”)的酵母细胞。使酵母菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，有利于吸收外源DNA色氨酸、亮氨酸融合表达载体和报告基因载体(4)已知LacZ基因表达产物，能将无色化合物X－gal水解成蓝色产物。Y2H和Y187接合生殖、培养时，如需筛选Y3H中含所需的“阅读器”，所需要进行的操作是：_______________________________________________________________________________________________________________。Y2H和Y187在含有无色化合物X－gal的培养基上完成接合生殖、培养，并在Y3H中挑选蓝色菌落角度2免疫共沉淀1.探究蛋白是否有相互作用 (1)加标签：通过构建融合基因完成，A蛋白添加Flag标签，B蛋白添加HA标签。 (2)拉蛋白：使蛋白提取混合物通过含有Flag抗体的介质，这样就可将含有Flag标签的蛋白质筛选出来。(3)共沉淀检测：该沉淀复合物如用A蛋白抗体检测为阳性，如图①，然后在沉淀复合物中添加HA标签的抗体，如果显示阳性，则表明A蛋白和B蛋白有相互作用，如图②，在沉淀复合物中添加B蛋白的抗体，如果