生物酶检测技术通则 编制说明

3本标准根据国标委公布的2024年第一批国家标准计划项目（国标委综合[2024]16本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。国酶学及酶制品等产业起步晚，当前国内生物酶处于性化检测涉及的生物酶品种多且性能要求高，因而大部分标准，因此阻碍了生物酶的发展，急需建立生物酶检测检测技术通则的问题，也可以解决核心原料检验技术受术通则工作将有利于提高生物酶及相关生物医药、洗涤（1）2022年6月至2022年10月，标准起草单位组织相关技术人员对通则》标准项目进行了预研，课题组成员广泛收集了国（2）2022年11月至2023年4月相关技术人员撰写了《生物酶质量评全体专家一致通过，同意牛刚任专家组组长。标4术路线说明、主要技术指标的确定等。专家工作组讨论稿进行了讨论和质询，同时对标准可能存物酶的质量进行评价。标准规定了生物酶的质量评价致性、保质期、文件要求）评价方法，评价内容等。作组还需按审查委员会提出的意见建议对标准进行修改14.3“活（性）力”统一参数统一为“活力”，工业上称为“活力”24.3“85%~115%”不合理在货架期内，应不低于标示值。酶活力随着时间的延长或降低。34.4“90%~110%”没有科学依据“生物酶的纯度应不低于标示值”。产品的纯度应有个确定值。44.8“85%”不科学去掉“85%”。保质期内实测酶活力不应低于标示值。5/工作要做深入选取代表性试剂，开展相关指标评价工作。6/无安全性指标增加安全性指标（5）2024年4月收到全国生化检测标准化技术委员会[2024]5号文件关于下达2024年准委关于下达2024年第一批国家标准制修订计划的通知》立项文件，计划编号：点在检测技术上，对应之前版本的质量检测指标，建检测技术，酶活力检测技术主要有光谱法、电化学方技术和其他方法（等离子共振法、偶联测定法等光谱法主要分为吸光光度法、荧光光5毛细管电泳杂质检测主要有化学法、光谱法、色谱法等；安全性检测中的重金属检测主要有原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、电感耦和等离子体发射光谱测主要有高效液相色谱法、质谱法、免疫法等；微生物检测参考食品微生物针对生物酶重要检测技术进行验证，如活力、纯度等，选取代表性生物酶如激酶等进行验证。技术通则》标准的起草工作，与会专家就《生物酶术通则》标准进行了修改和完善。完成了《生物酶国生化检测标准化技术委员会提交了《生物酶检测技术通则》检验规则等）及其确定依据（包括试验、统计数据修订国家标准时2）本标准严格遵循现行相关法律法规和其他标准，确保在各个层面上与现有规范协3）在标准的编制过程中，严格按照GB/T1.1-2020等系列标准的规定，对标准的结构编排、编写格式和内容表达方法等进行统一2、确定国家标准主要内容（如技术指标、参数、6质量指标以及检测方法，因此生物酶质量评价通则的质量指标，主要有外观、酶活力、比活力、质期等，因此综合以上指标确定生物酶的质量评价杂质、安全性、批内、批间差异、保质期，后面标类型标准编号标准名称发布日期实施日期国家标准GB/T36755-2018BSTDNA聚合酶2018-09-172019-04-01国家标准GB/T36757-2018M-MLV反转录酶2018-09-172019-04-01国家标准GB/T36389-2018T4DNA连接酶2018-06-072019-01-01国家标准GB/T36390-2018工具酶溶菌酶2018-06-072019-01-01国家标准GB/T35542-2017TaqDNA聚合酶2017-12-292018-07-01国家标准GB/T35540-2017限制性凝血酶2017-12-292018-07-01国家标准GB/T35543-2017核糖核酸酶A2017-12-292018-07-01国家标准GB/T35539-2017限制性核酸内切酶BamHI2017-12-292018-07-01国家标准GB/T35541-2017pfuDNA聚合酶2017-12-292018-07-01国家标准GB/T34793-2017蛋白酶K2017-11-012018-05-011酶的活力和比活力光谱法（吸光光度法、荧光光谱法、浊度测定类型标准编号标准名称检测技术国家标准GB/T36756-2018工具酶活性测定通用要求/国家标准GB/T41906-2022超氧化物歧化酶活力检测方法-分光光度法分光光度法国家标准GB/T41712-2022脱氧核糖核酸酶Ⅰ酶活及杂质检测方法分光光度法国家标准GB/T5521-2008粮油检验谷物及其制品中α-淀粉酶活性的测定分光光度法国家标准GB/T41907-2022肠激酶活性检测方法分光光度法国家标准GB/T34776-2017T4DNA接酶酶活及杂质检测方法琼脂糖电泳国家标准GB/T34222-2017核糖核酸酶活力检测方法分光光度法国家标准GB/T34801-2017脱氧核糖核酸酶活力检测方法分光光度法国家标准GB/T33410-2016生化试剂中蛋白酶K活性检测方法分光光度法国家标准GB/T34800-2017蛋白酶K酶活力及杂质检测方法分光光度法国家标准GB/T30990-2014溶菌酶活性检测方法分光光度法7国家标准GB/T32131-2015辣根过氧化物酶活性检测方法比色法分光光度法国家标准GB/T33409-2016β-半乳糖苷酶活性检测方法分光光度法分光光度法国家标准GB/T34795-2017谷氨酰胺转胺酶活性检测方法分光光度法国家标准GB/T34799-2017几丁质酶活性检测方法分光光度法行业标准NY-3799-2020生乳及其制品中碱性磷酸酶活性的测定发光发光法国家标准GB/T8622-2006饲料用大豆制品中尿素酶活性的测定电化学方法1.1反应条件的选择要点反应条件对酶活力测定结果影响很大，反应条1.1.1底物类型和浓度（2）对于专一性不强可使用多种底物的酶，所选用的底物必须有足够的特异性，通常选底物浓度的确定：米氏常数(Km值)是用mol/L表示，对于单底物酶促反应，应选择底物浓度为Km的（10~20）倍。双底物酶促反应速度达到最大反应速度的程度一般要求为1.1.2反应温度对多数酶，其酶活最适宜温度在（37~40）℃,但有些生物机体相当低的温度下工作。多数哺乳动物来源的酶，1.1.3反应pH值会降低酶活性。主要表现在两个方面：①改变底物和底物的结合；②过高或过低的pH都会影响酶的稳定性，进而配制同一pH的缓冲液常常可使用多种化学试剂，此时不仅要考虑试剂的pKa值，以保证有足够的缓冲能力，还要考虑试剂本身是否具有抑制或根据酶在不同pH条件下的活性绘制曲线，1.1.4反应时间在一定的时间范围内，最终产物的生成量是与酶活件确定的情况下，可以通过试验得到反应时间和产物浓1.1.5缓冲液和离子强度在方法设计时，选完缓冲物后，还必须了解不言，随缓冲液浓度增加，电解质干扰酶和底物结合，浓度时，常需在浓度较高以保持足够缓冲能力和浓度对于生物缓冲液，如三羟甲基氨基甲烷、三乙将pH调到要求范围。不控制温度，不用pH计盲目进行配1.1.6其他因素辅助因子是与酶蛋白疏松结合的小分子量的辅基多为金属离子，如K+、Na+、Ca），9值得注意的是，很少量的激活剂或抑制剂就和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶抑制剂。例如，氯化钠达到三分之一饱和度时就可值得注意的是，酶活性的发挥与介质有关，经常测定结果并不会成正比例地改变，可能与激活剂、等因素有关。因此，样品与反应液总量的比例一当的波长，测定反应过程中反应进行的情况。该方法变化，已成为酶活力测定中一种重要地方法之一。几1.2紫外-可见分光光度法可见光部分的光吸收度的不同，选择一适当的波长，测方法可以连续地读出反应过程中光吸收的变化，已成为酶活力测定中一种重要得方法之一。表3可见现有的国家标准中酶活性的检测方法几乎都用的此方法，该方法特别适用于含有不饱和键，尤其是含有共轭体系的化合物的分析和测定手段，几乎所有的氧化还原酶都可以采用此法进行光光度法。如蛋白酶类（木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性/碱性/酸性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶）、溶菌酶、a-淀粉酶（中温、耐高温）、纤维素酶、果胶酶、乳糖酶、谷氨酰蔗糖酶，血清中肌酸激酶、乳酸脱氢酶、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和γ-谷氨酰基转移酶的参考测量方法中，均采用紫外-可见分光光度法，紫外-可见吸光光度设备价格相对低廉，成本较低，操作简便，应用范围广泛，可检测到nmol·L-1水平的变化；该方法的1.3荧光分光光度法有高灵敏度和高专一性的优点，如可用来测定端1.4色谱技术底物或产物可以通过其物理性质的不同进行分离鉴），分离色谱法、凝胶过滤色谱法、气相色谱法等，这些相色谱法因其高效、快速、高灵敏度等特点在酶活1.5质谱技术质谱技术用于生物酶活性的检测，是对游离酶质谱对产物或底物进行测定，是常用的质谱检测生以是有机物，也可以是无机物，被分析的样品形态可敏度、高通量和高选择性的优点，样品用量少，能够1.6其他技术2生物酶的纯度生物酶的纯度，是从生物酶样品中确定目标类型标准编号标准名称检测技术国家标准GB/T40174-2021工具酶纯度的检测方法国家标准GB/T34223-2017核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法2.1.1光谱扫描法一种纯度的生物酶溶液在一定的波长范围内进行光谱扫描就会得到一个特征吸收光谱，可以根据扫描光谱的吸收曲线的形状，吸收峰的位用紫外吸收光谱测定生物酶的纯度，既方便2.1.2光吸收比值法一种纯物质在紫外光区有其最大吸收峰，如核酸的最大吸收峰在260nm，蛋白类生物酶的最大吸收峰在280nm，同一溶液在这两种波长下测得的光吸收值是不同的，利用在280nm和260nm处测得的光吸收值之比，即可得到蛋白类生物酶的纯度，如纯核酸的标准特点：仅限于蛋白类生物酶溶液中含有核酸或核2.2.1保留值法在一定的层析条件下各种生物酶组分在层析柱内的如：排阻层析根据生物酶不同的分子量可得到不同2.2.2基准物标定法2.2.3层析的模式层析分析鉴定法的方法很多，但根据层析的分离机制来分2.2.4几种层析方法的比较表5常见的层析方法电泳鉴定生物酶纯度的方法有：净电荷电泳（PAGE）、SDS-电泳（SDS）、等电聚焦电泳（IEF）、双向电泳（2D-PA），表6常见的电泳方法3生物酶的杂质类型标准编号标准名称检测技术国家标准GB/T34776-2017T4DNA接酶酶活及杂质检测方法国家标准GB/T34800-2017蛋白酶K酶活力及杂质检测方法分光光度法国家标准GB/T41712-2022脱氧核糖核酸酶Ⅰ酶活及杂质检测方法分光光度法生物酶的杂质主要有工艺相关的杂质和产品响生物酶纯度的主要因素，如果生物酶中含有生物酶中杂质的分析技术包括化学法、光谱降解产物的特性采用不同的检测技术，对于生物酶中法主要为高效液相色谱法、气相色谱法和毛酸酶和/或RNase残留等杂质，通常采用酶与核酸底物孵育，琼脂糖凝胶电泳的方式检通过检测核酸底物的降解情况，判断核酸酶的残留情测宿主细胞核酸(HCD)和宿主细胞蛋白（HCP）残留。宿主细胞核酸检测可采用DNA探针杂交法、荧光染色法或定量PCR法；宿主细胞蛋白可采用酶联免疫吸附法、质谱分析法、4批内、批间差异检测批内差异检测是相同测量程序、相同操作者、相同点，在短时间段内对一批内样品进行重复测量，至少进同测量程序、相同操作者、相同测量系统、相同操作条件和相同地点，3个不同批号的生物酶制品，每个批号重复测量3次，计算均值，同时按以下公式计算相对极差，则为生物1N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐234RO水调零，使用磷酸盐缓冲液或底物原液调节溶液吸于0.585应逐步添加约0.5mL～1mL磷酸盐缓冲液以确保在吸光度范围内，配表9主要测定仪器(分光光度计)和主要辅助仪器列表名称要求电子天平精度0.00001紫外-可见分光光度计恒温水浴pH计移液器200uL、1000uL、5mL点式温度计表10胰蛋白酶活性测定条件参数指标温度25℃±0.1℃波长光径10.00mm±0.1mm测定时间读数(测定点)②将底物工作液和酶溶液在25℃±0.5℃平衡。③取光程为1cm的带盖石英比色皿，用5mL移液器加入底物溶液（恒温于25.0℃±0.5℃)3.0mL放入分光光度计比色池，用点式温度计测量比色皿内温度，待温度恒定至25.0℃±0.1℃时，用200μL移液器加入0.001mol/L盐酸溶液200μL，搅拌混匀，作为空即计时，每隔30s读取吸光度，共5min。记录每个时间点下的吸光度值，每30s吸光度的P=对胰蛋白酶活性测定方法线性范围、准确度、精密本研究胰蛋白酶活性测定方法中胰蛋白酶工作浓度为50U/mL-60U/mL，因此将标准测定方法重复测定活性3次，绘制不同酶浓度与吸光度变化平均值的关系图并计算线性回吸光度变化值及活性数据如表5所示，不同酶浓度与吸光度变化平=0.0003x-0.0008，r=0.9948知，本方法在25U/mL～250U/mL范围内测出的活性相对标准偏差为3.44%，表明在此范图1不同酶浓度与吸光度变化平均值的线性图浓度（U/mL）吸光度变化值吸光度变化平均值0.007424.7250.00850.00790.01730.008228.327.830.555.0550.01580.01570.02120.016553.854.554.895.20.02130.02140.028795.295.796.70.04480.04500.04580.05970.04522000.05770.05700.07750.058258.32500.08050.07900.079268.3263.3263.3用0.001mol/LHCl将胰蛋白酶稀释至66U/mL、55回收率=高（1.2:1）、中（1:1）、低（0.8:1）胰蛋白酶浓度下的试验数据如表6所示，结果显及AOAC《GuidelinesforSingleLaboratory活性（U/mL）平均活性（U/mL）回收率（%）平均回收率（%）66554465.766.765.755.053.854.843.843.046.266.054.544.3100.0099.15100.6899.94依法测定胰蛋白酶活性，重复测定6次，计算6次重复性试验结果如表7所示，结果显示重复性试验的相对标准偏差为1.76%，表明表13重复性试验结果重复次数活性（U/mg）平均活性（U/mg）RSD（%）1230203307330171.76429935295662974换一个操作人员，换一台设备采用相同方法测6次再现性试验结果如表8所示，结果显示再现试验的相对标准偏差为1.76%，表明此表14再现性试验结果重复次数活性（U/mg）平均活性（U/mg）RSD（%）1234320756糜蛋白酶是与胰蛋白酶作用、用途相似的酶，能迅取过程中容易残留的杂质，因此将建立的胰蛋胰蛋白酶溶液在不同厂家的设备上测定活性，重复测定3次，计算相对标准偏差。不表15不同设备试验结果设备名称活性（U/mg）平均活性（U/mg）RSD（%）谱析-单光束320131714.13谱析-双光束岛津-双光束3147316533293456342034763133303831123165葡萄糖脱氢酶（GDH）以D-葡萄糖（D-Glucose）为底物，将D-葡萄糖氧化，同时还原吩嗪硫酸甲酯（Phenazinemethosul（Sodium2,6-dichloroindophenolatehydrate,DCIP）进一步氧化还原反应的DCIP，此过程中DCIP的颜色由蓝色转为无色，氧化态DCIPpMS⃞p.PMS(还原态)+DCIP—→PMS+DCIP(还原态)①试剂Ⅰ：50mMPIPES-NaOH配制完成后6小时内使用完毕）议配制完成后6小时内使用完毕）将1mg/mL的供试品用冰预冷的酶稀释液在冰上进一步稀释约4000-8000倍（稀释至ΔA—酶促反应进行每分钟的吸光值变化，ΔAdf—稀释倍数；16.8—2,6-二氯靛酚钠盐在600nm处的微摩尔消光系数，单位为平方厘米每微摩尔内，测得活性RSD在实际测量值与标称值差实际测量值与标称值差 在0.05-0.20U/mL范围内，测得葡萄糖脱氢酶的活性RSD在表17线性范围验证结果样品名称稀释酶活梯度测得酶活性（U/mL）平均酶活性（U/mL）RSD（%）葡萄糖脱氢酶0.20U/mL14567.1714782.4820.10U/mL14604.100.05U/mL15176.16果如下表所示。结果表明，所有的葡萄糖脱氢酶均因此标称活性与本检测结果也会存在差异。这也进表18准确度验证结果样品名称厂家标称酶活性（U/mL）测得酶活性（U/mL）测得酶活性/标称酶活性（%）葡萄糖脱氢酶Av2000021994.59葡萄糖脱氢酶Bh50004510.9290葡萄糖脱氢酶Cx2027414506.6172葡萄糖脱氢酶Dd1000010735.06表19精密度（重复性）验证结果样品名称酶活性1（U/mL）酶活性2（U/mL）酶活性3（U/mL）平均酶活性（U/mL）RSD（%）葡萄糖脱氢酶A20104.8321938.4723940.4621994.599葡萄糖脱氢酶B4390.774760.364381.634510.925葡萄糖脱氢酶C14371.6014835.5714312.6614506.612葡萄糖脱氢酶D10442.6610660.7710735.063测定原理CUNG，尿嘧啶-DNA糖基化检测到荧光，且荧光值与DNA量在一定范围内成正比。此实验过程移液器、掌上离心机、微孔板离心机、涡旋混匀③PicoGreen染色液：按100μL1×TE+0.5μLpicogreen体系配制工作液表20反应体系试剂体积(μl）DDWto5010×Taq缓冲液5dUTPmix1UDNA-F(10μM)2UDNA-R(10μM)2LamdaDNA(1ng/μl)1TaqDNA聚合酶(5U/μl）2.5表21反应体系组分体积μlDDW10×Taq缓冲液2UDNA验证结果表22验证结果项目可接受标准验证结果结论精密度重复性：测定3次的数据CV≤10.0%中间精密度：三个分析人员重复性：一个人测定3次的数据CV为4.39%。中间精密度：三个分析人员合格线性范围1.线性验证：曲线上下平台至少2个点，指数增长期至少3个点。2.R2≥0.991.S曲线的上平台和下平台有3个点，指数增长期有3个点2.R2＞0.99合格在0.017-100mU/μL范围内，测定酶浓度与双链DNA荧光值的关系，拟合非线性回归曲线，R2＞0.99。见下表表23线性范围验证结果荧光值酶浓度mU/μL实验1实验2实验356635545.4545454559716120.661157027591789.3914350114.2688340962682982561.9403791354415014440.8819905166547596610.400904788299738640.182229445103011089880.0828315661076115510680.0376507121117120510860.01711396113212291090上平台点数333下平台点数333指数增长期666ES501.1