第2章 沉淀法课件

纯化方法第2章沉淀法沉淀法色谱法电泳法第2章沉淀法第二章沉淀法第2章沉淀法第一节

基本原理与沉淀类型一、基本原理二、制备蛋白质三、制备核酸第2章沉淀法一、基本原理沉淀法也称溶解度法。基本原理：根据各种物质的结构差异来改变溶液的某些性质（如：pH、极性、离子强度、金属离子等)，从而使抽提液中有效成分的溶解度发生变化。第2章沉淀法二、制备蛋白质蛋白质是稳定的胶体溶液。其原因有二：水化膜的存在同性电荷的相互排斥作用第2章沉淀法蛋白质沉淀方法盐析法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法蛋白质沉淀法聚乙二醇沉淀法选择性沉淀法结晶沉淀法第2章沉淀法1．

盐析法盐溶(salting-ineffect)：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度随盐浓度的升高而上升。盐析(salting-outeffect)：当盐浓度增高到一定数值时，蛋白质溶解度又逐渐下降，直到蛋白质析出。第2章沉淀法盐析原理示意图第2章沉淀法盐析一般操作步骤：部分杂质“盐析”，有效成分“盐溶”离心分离得上清液有效成分等物质“盐析”，部分杂质“盐溶”离心收集沉淀物初步纯化的有效成分物质第2章沉淀法①

盐的选择

蛋白质沉淀，常选用硫酸铵。优点：1.

溶解度大，对温度不敏感。水温25℃，硫酸铵的饱和溶解度为769g(4.1M)

水温为0℃，其饱和溶解度为679g(3.9M)；2.

分级效果好。去杂75%以上；3.

有稳定蛋白质结构的作用。经2-3M硫铵盐析的蛋白可置低温保存1年以上；缺点：继续纯化时，需脱盐。（1）盐分级沉淀第2章沉淀法②硫酸铵盐析A．固体法B．饱和溶液法C．透析法第2章沉淀法第2章沉淀法（2）

脱盐方法：凝胶过滤法、透析法第2章沉淀法第2章沉淀法2．

有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：1、与盐溶液一样具有脱水作用，2、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。常用的有机溶剂是甲醇、乙醇和丙酮。第2章沉淀法注意：①低温操作有机溶剂预冷至一10℃，操作在低温进行。②中性盐的作用宜在稀盐溶液或低浓度缓冲液中进行。③多价阳离子的作用有些蛋白质和多价阳离子(如Zn2+、Cu2+等)能结合形成复合物，致使蛋白质在有机溶剂中的溶解度降低。第2章沉淀法3．

蛋白质沉淀法(1)

碱性蛋白质如：鱼精蛋白(2)

凝集素如：植物凝集素(3)重金属第2章沉淀法4．

聚乙二醇沉淀法聚乙二醇〔ployethyleneglycol,PEG〕和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。沉淀条件温和，不易引起蛋白质变性，而且沉淀较完全，因此应用范围颇广。但是，它也受各种因子如pH、离子强度、蛋白质浓度以及聚合物分子量的影响。第2章沉淀法5．

选择性沉淀法例如：从酵母菌细胞中纯化醇脱氢酶时就采用了改变温度的选择性沉淀法。将酵母干粉加磷酸氢二钠溶液于37℃水浴保温2小时室温搅拌三小时。离心收集上清液，升温至55℃，保持20分钟后，迅速冷却，离心去除热变性蛋白。上清液即为热稳定的醇脱氢酶溶液。根据蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的特点。第2章沉淀法酵母干粉＋磷酸氢二钠离心收集上清液室温搅拌3小时37℃，2小时热稳定的醇脱氢酶溶液。离心得上清55℃，20分钟，迅速冷却第2章沉淀法6．

结晶沉淀法蛋白质沉淀：晶体沉淀无定形沉淀(非晶体)当某一纯蛋白质溶液的浓度达到较高(5%-30％)水平时．只要条件适合，就能产生一定形状的结晶。当蛋白溶液中混有杂质时，即使条件适合、也得不到整齐的结晶，或无结晶形成。因此，用显微镜观察结晶的有无及形状，也可作为判断提纯物质纯化程度的一种方法。第2章沉淀法三、制备核酸第2章沉淀法

核酸的分离与纯化

就基因工程而言，核酸分子是其研究所涉及的主要对象，所以核酸的分离与提取是研究中很重要的基本技术。核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。第2章沉淀法核酸的分类DNA

主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。

RNA

存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。第2章沉淀法核酸制备的一般原则分离纯化核酸总的原则：①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子的污染。核酸纯化应达到的要求：①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其它生物大分子的污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。第2章沉淀法核酸制备的一般原则核酸制备时应注意的事项:①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。②减少化学因素对核酸的降解。pH4-10③减少物理因素对核酸的降解。机械剪切力和高温④防止核酸的生物降解。第2章沉淀法核酸制备的一般原则核酸制备的步骤：破碎细胞提取纯化第2章沉淀法核酸制备的一般方法和原理核酸酶的抑制和抑制剂

降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。第2章沉淀法核酸制备的一般方法和原理DNase抑制①加入少量金属离子螯合剂，如0.01mol/LEDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。第2章沉淀法核酸制备的一般方法和原理RNase抑制①操作要带手套。②所有器皿要严格消毒，③试剂处理④低温操作⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。第2章沉淀法核酸制备的一般方法和原理核酸制备中常用的去垢剂

核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：

1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；

2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；

3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。第2章沉淀法核酸制备的一般方法和原理核酸制备中常用的去垢剂

SDS

脱氧胆酸钠

4-氨基水杨酸钠萘-1.5-二磺酸钠三异丙基萘磺酸钠第2章沉淀法核酸制备的一般方法和原理核酸制备中常用的蛋白质变性剂

蛋白质变性剂的作用：

1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。

2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。

3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。

第2章沉淀法核酸制备的一般方法和原理核酸制备中常用的蛋白质变性剂

苯酚氯仿盐酸胍

DEPC第2章沉淀法核酸制备的一般方法和原理核酸制备中常用的酶制剂

DNaseRNase

蛋白酶K

溶菌酶

第2章沉淀法核酸样品的保存

核酸保存的主要条件是温度和介质

温度：

4℃最佳和最简单

-70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存

-20℃保存

保存介质：

TE缓冲溶液(最常用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0

第2章沉淀法第二节离心分离技术

离心分离技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据物质颗粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同，而使物质分离的技术。第2章沉淀法一、离心机的种类与用途按用途分：分析用、制备用、分析－制备用按结构特点分：管式、吊篮式、转鼓式和碟式按离心机转速分：常（低）速、高速、超速第2章沉淀法1.常速离心机又称低速离心机最大转速：8000rpm相对离心力：＜1×104g主要用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣等固形物及粗结晶等较大的颗粒。RCF=1.12×10-5×r×n2

RCF=相对离心力

r=旋转半径（厘米）n=每分钟转数第2章沉淀法2.高速离心机转速：1×104－2.5×104rpm相对离心力：1×104－10×105g主要用途：分离各种沉淀物、细胞碎片、较大的细胞器等高速冷冻离心机第2章沉淀法3.超速离心机转速：2.5×104－8×104rpm相对离心力：5×105g第2章沉淀法二、离心分离方法的选择离心分离的方法可分为二类：

1.差速离心

2.密度梯度离心

第2章沉淀法原理：采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法，称为差速离心法。当以一定离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在大离心力的条件下进行离心，又得到第二部分较大、较重颗粒的“沉淀”，如此，多次离心处理，即能把液体中的不同沉降速度的颗粒分批分离出来。常用于分离大小和密度相差较大的颗粒。1、差速离心法第2章沉淀法第2章沉淀法2.密度梯度离心

原理：样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质分离的一种区带分离方法。每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以在