人胸腺肽β4基因在大肠杆菌中的克隆、表达、纯化及促血管生成生物活性研究

人胸腺肽β4基因在大肠杆菌中的克隆、表达、纯化及促血管生成生物活性研究〔作者:___________单位:___________:___________〕

【摘要】目的：在大肠杆菌中克隆和表达人源胸腺肽〔thymosinβ4，TB4〕基因并进行别离纯化及促血管生成生物活性鉴定。方法：人工设计TB4基因片段，其密码子为大肠杆菌所偏爱，将合成的寡核苷酸片段经分子克隆拼接成TB4基因片段，与pET28a(+)载体连接成重组表达质粒pET28aTB4，将其转化大肠杆菌BL21〔DE3〕，经IPTG诱导表达带His6Tag的融合蛋白His6TB4，通过镍柱亲和层析纯化，采用SDSPAGE分析鉴定，由CAM试验进行重组蛋白活性的生物活性鉴定。结果：经DNA序列分析鉴定，重组质粒pET28aTB4构建成功，IPTG诱导后的融合蛋白His6TB4在大肠杆菌中得到高效表达，并经一步镍柱亲和层析即获得纯化。CAM试验证明其有促进毛细血管生成的活性。结论：获得高效表达的、高纯度的His6TB4融合蛋白，为TB4的进一步的功能分析和促血管生成生物活性研究奠定了根底。

【关键词】人胸腺肽β4表达镍柱纯化鸡胚尿囊膜实验

胸腺肽β4〔thymosinβ4,TB4〕是从胸腺素组分5〔F5〕中别离得到的，是生物体内丰度最高且高度保守的一种βthymosin。它不仅存在于胸腺中，还存在机体众多组织中，在参与调节免疫及细胞生理活动等一系列过程中呈现功能多样性，因此引起了研究者的广泛关注[12]。TB4是由43个氨基酸残基组成的多肽，相对分子质量约5000，等电点5.1，以前多认为其定位于细胞浆中，目前有报道说它也有细胞核的定位[3]。最近报道说明，TB4可以促进毛细血管生成和创伤愈合，降低炎症反响，抑制一些上皮细胞的凋亡，在医学治疗疾病中大有潜力[46]。本研究设计并合成TB4的编码基因，在大肠杆菌中实现它的高效表达，进行别离纯化，并进行其促毛细血管生成活性初步鉴定，旨在为今后对TB4蛋白功能的进一步研究和药物开发打下根底。

1材料和方法

1.1试剂、质粒及菌株

pET28a(+)质粒、大肠杆菌Top10、BL21(DE3)由本实验室保存；PCR试剂、限制性内切酶、Klenow酶、T4连接酶等酶类购自大连TaKaRa公司；IPTG购自华美生物工程公司；3S柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒购自上海申能博彩生物科技；MicroBCAKit购自PIERCEChemical公司；NiIDA填料由本实验室提供。

1.2方法

1.2.1重组质粒的构建

1.2.1.1TB4目的基因片段的获得TB4基因序列来源于NCBI数据库，并根据大肠杆菌密码子偏爱性，对其进行适当的修改。设计5个基因片段，由上海英骏〔Invitrogen〕公司合成。

1.2.1.2TB4基因的拼接将合成的基因片段1〔5′ATGTCTGACAAACCGGACATGGCTGAAATCGAAAAATTCGACAAATCCAAACTGAAG3′〕和基因片段2〔5′TTTGGACGGCAGCGGGTTTTTTTCCTGAGTTTCAGTCTTCTTCAGTTTGGATTT3′〕退火，利用Klenow酶延伸补平；相同的方法将基因片段3〔5′AACCCGCTGCCGTCCAAAGAAACTATCGAACAGGAAAAACAGGCTGGTGAATCCTAG3′〕和基因片段4〔5′GGCGAGCTCTAGGATTCACCAGCCTG3′〕退火补平。两次退火得到2个DNA大片段〔A和B〕，将DNA大片段A和B退火延伸即得到TB4基因。

1.2.1.3PCR扩增TB4基因以退火得到的TB4基因为模板，基因片段5〔5′GGAATTCCATATGGACGACGACGACAAGATGTCTGACAAACCGGAC3′〕和基因片段4为引物，进行PCR扩增〔图1〕。PCR循环参数为：95℃预变性5min；95℃变性40s，58℃复性40s，72℃延伸40s,循环28次；末次延伸为72℃10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶纯化试剂盒纯化。

图1TB4目的基因合成过程示意图

1.2.1.4pET28aTB4重组质粒的构建与测序鉴定将纯化后得到的TB4基因片段用NdeI和SacI双酶切，用T4连接酶连接于已同样酶切的pET28a(+)质粒中，再转化大肠杆菌Top10，卡那霉素抗性板筛选阳性克隆，挑单菌落进行PCR鉴定为阳性的克隆送上海英骏〔Invitrogen〕公司测序鉴定。

1.2.2融合蛋白His6TB4在大肠杆菌中的诱导表达和纯化

将重组质粒pET28aTB4转化BL21(DE3)大肠杆菌，挑单克隆于1L含卡那霉素的新鲜LB液体培养基中37℃摇菌培养，当其A600到达0.8时，参加终浓度为1mmol·L-1IPTG，诱导35h；离心收获菌体，进行SDSPAGE分析。将表达菌体重悬于60mlBufferB〔0.05mol·L-1Na3PO4,0.3mol·L-1NaCl,0.01mol·L-1imidazole,pH8.0〕，进行超声破碎细菌，然后离心取上清，上样由BufferB平衡过的NiIDA亲和层析柱，再用BufferC〔0.05mol·L-1Na3PO4,0.3mol·L-1NaCl,0.05mol·L-1imidazole,pH8.0〕洗层析柱去除杂蛋白，最后通过BufferD〔0.05mol·L-1Na3PO4,0.3mol·L-1NaCl,0.25mol·L-1imidazole,pH8.0〕洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。

1.2.3鸡胚尿囊膜血管生成实验〔choriollantoicmembraneassay，CAM实验〕

我们用CAM模型检测His6TB4对体内血管生成的作用[7８]。取材孵育7d的活受精鸡胚，在蛋壳上开窗暴露尿囊膜，将灭菌圆形滤纸片〔约7mm2〕放置于尿囊膜毛细血管新生区，用微量加样器将200μg·ml-1过滤除菌的融合蛋白溶液〔PBS配制〕和PBS缓冲液〔对照〕各50μl加于滤纸片上，用灭菌的滤纸和胶布封闭窗口，60h后揭开滤纸片观察毛细血管生长的情况。

2结果

2.1TB4基因的克隆和重组

我们按照大肠杆菌偏爱的密码子，人工合成了TB4基因片段，然后拼装成TB4全基因。经电泳鉴定，成功拼装获得与预期长度大小一致的TB4基因片段,约135bp〔图2〕。获得的TB4基因片段经过NdeI和SacI双酶切，将目的片段插入pET28a(+)质粒中，pET28aTB4质粒图谱如图3。重组质粒经PCR鉴定为阳性克隆，经DNA测序证明目的基因序列完全正确。设计的TB4基因全序列如下：5′ATGTCTGACAAACCGGACATGGCTGAAATCGAAAAATTCGACAAATCCAAACTGAAGAAGACTGAAACTCAGGAAAAAAACCCGCTGCCGTCCAAAGAAACTATCGAACAGGAAAAACAGGCTGGTGAATCCTAG3′。

２．２融合蛋白His6TB4的诱导表达和别离纯化

经SDSPAGE分析说明，重组蛋白在大肠杆菌中实现了高效表达，其中融合有His6Tag的TB4蛋白相对分子质量约为8000，与理论值相符。由于TB4蛋白N端融合有HisTag，融合蛋白可利用镍柱亲和层析一步纯化获得目的蛋白，纯化过程简单、高效。经SDSPAGE扫描分析，His6TB4重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的40%，一步亲和层析纯化后样品的纯度可到达93.5%左右，见图4。

2.3CAM试验检测融合蛋白活性

与对照相比，TB4对毛细血管生成有促进作用，与文献[9]报道吻合，如图5所示。给药部位较周边的毛细血管生成有所促进，并且有所增粗，而对照组的滤纸片及其周边的毛细血管生成根本没有改变。

图5重组TB4对鸡胚尿囊膜的促血管生成作用

3讨论

胸腺肽是一种应用较早的免疫药物，由于近年来发现胸腺肽β家族成员的功能不仅限于与肌动蛋白结合，影响细胞的生长和迁移，而且在免疫、血管生成、神经再生、肿瘤浸润、创伤愈合和炎症反响等多方面均有作用，同时，也为一些疾病的诊断和治疗提供了新的研究思路，从而越来越多地引起众多研究者的注意[12，10]。采用基因工程方法生产重组TB4蛋白，可以防止从生物原材料中直接提取率低或直接化学合成本钱代价高等缺点。国内陈妍柯等[11]也曾报道过在大肠杆菌中克隆表达了TB4，其表达水平占菌体总蛋白的30%，但其纯化步骤较为复杂，分别经过了硫酸铵盐析、SourceRPC反相层析柱和QSepharoseHP阴离子交换柱来纯化目的蛋白，他们主要侧重于研究TB4的免疫学活性。本研究中，我们在大肠杆菌中高效表达了His6TB4，表达产物占菌体总蛋白的40%，表达产物经过一步镍柱亲和层析即可获得别离纯化，方法简易、获得的TB4重组蛋白纯度为93.5%。CAM实验说明，我们获得的His6TB4具有很好的促血管生成的生物活性。我们建立了TB4大肠杆菌基因工程高效表达菌株，表达水平高，别离纯化工艺简便、本钱低，为以后的TB4作为促进血管生成药物的开发和深入研究奠定了坚实的根底。

【参考文献】

[1]CHENC,LIM,YANGH,etal.Rolesofthymosinsincancersandotherorgansystems[J].WorldJSurg,2005,29(3):264270.

[2]HUFFT,MULLERCS,OTTOAM,etal.Betathymosins,smallacidicpeptideswithmultiplefunctions[J].IntJBiochemCellBioL,2001,33(3):205220.

[3]HUFFT,ROSORIUSO,OTTOAM,etal.NuclearlocalisationoftheGactinsequesteringpeptidethymosinbeta4[J].JCellSci,2004,117(Pt22):53335341.

[4]BOCKMARQUETTEI,SAXENALA,WHITEMD,etal.Thymosinbeta4activatesintegrinlinkedkinaseandpromotescardiaccellmigration,survivalandcardiacrepair[J].Nature,2004,432(7016):466472．

[5]CHAHJ,JEONQMJ,KLEINMANHK.Roleofthymosinbeta4intumormetastasisandAngiogenesis[J].JNatlCancerInst,2003,95(22):16741680.

[6]PHILPD,GOLDSTEINAL,KLEINMANHK.Thymosinbeta4promotesangiogenesis,woundhealing,andhairfollicledevelopment[J].MechAgeingDev,2004,125(2):113115.

[7]HEHIRKM,BAGUISIA,PENNINGTONSE,etal.Apotentialantitumorpeptidetherapeuticderivedfromantineoplasticurinaryprotein[J].Peptides,2004,25(4):543549.

[8]颜明,华子春.人快速收缩骨骼肌肌钙蛋白Ⅰ在大肠杆菌中的表达及建立其快速复性方法[J].东南大学学报:医学版,2005,24(1):3638.

[9]KOUTRAFOURIV,LEONDIADISL,AVGOUSTA