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DB13DB13/T1767—2013苹果品种DNA指纹鉴定2013-09-05发布2013-09-30实施河北省质量技术监督局发布I1本标准适用于苹果品种鉴定及河北省苹果品种DNA不同苹果品种由于遗传组成不同，基因组DNA中简单重复序列的重复次数有差异，这种差异可经过扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（或通过DNA分析仪、测序仪进行分离），并通过染色显示DNA4溶液配制苹果品种DNA指纹鉴定相关溶液配制方法5鉴定方法5.1样品准备5.1.1取样量5.1.2品种比较方式送检样品提供两份，一份为待检品种，一份为对照品种。将待检品种与对照品种直接进行成对比2并加1mL洗涤液及30μLβ-巯基乙醇，充分摇匀后置冰上5min，于4℃,12000g离心8min后，洗涤5.2.2其它保证DNA质量的方法也可采用5.3.2反应体系225mmol/L2.5mmol/L22.5mmol/L0.15mmol/L20μmol/L0.25DNA15.3.3反应程序94℃预变性5min；94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s,共30个循环；72℃延伸7min，4℃保5.4.1清洗玻璃板用自来水沾洗涤灵将玻璃板反复擦洗干净，双蒸水擦洗两遍，95%乙醇擦洗两遍，干燥。在长板上涂上0.5mL亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5mL剥离硅烷工作5.4.2组装电泳板35.4.3灌胶5.4.4预电泳在正极槽中加入1×TBE缓冲液600mL，在负极槽(上槽)加入预热至65℃的I×TBE缓冲液600mL，拔5.4.5变性5.5.1银染流程图6结果及判定4谱带记录方式:每个核心引物的所有谱带按扩增片段02..….)，并确定代表每条谱带的一套标准品种。c)品种间差异位点数＝0，判定为相同c)品种间差异位点数＝0，判定为相同5A.1仪器设备A.1.1PCR核酸扩增仪:规格为96孔;A.1.2序列分析电泳槽;A.1.3高压电泳仪:规格为3000VA.1.4水平摇床;A.1.5胶片观察灯;A.1.7微量加样器;A.1.8磁力搅拌器;A.1.9高速离心机A.1.10微量紫外分光光度计A.1.11高压灭菌锅;A.2试剂A.2.2Tris碱;A.2.3盐酸;A.2.4氢氧化钠;A.2.7TaqDNA聚合酶;A.2.8SSR引物;A.2.9矿物油;6A.2.10A.2.11A.2.12A.2.13A.2.14A.2.15A.2.16A.2.17A.2.18A.2.19A.2.20A.2.21A.2.22A.2.23A.2.247lmol/LTris-HC15rnL，0.5m82%二甲基二氯硅烷。91I2I3I4I5I6I7I8ICH01f03b9IIIIIIIIIHi02c0712MS14h0334CH05f06567CH01f0989CH02B03bCH04f10注：I型标记含首先采用的17对引物，II型标记含候补采用的1

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