2025人呼吸道合胞病毒中和抗体检测技术指南

Guidelinesfordetectionofneutralizingantibodytohumanrespiratorysyncytial 前 引 附录A（资料性）试剂配 附录B（资料性）血清稀释及96孔细胞培养板加样示 人呼吸道合胞病毒是全球范围内婴幼儿急性呼吸道感染的主要病原体之一。尽管疫苗和单克隆抗包括微量中和实验和噬斑减少中和实验。微量中和实验对于某些病变不明显的人呼吸道合胞病毒毒株neutralizing噬斑FBS：胎牛血清（FetalBovineHEp-2：人喉表皮样癌细胞（HumanLarynxEpidermoidCarcinomaCells）HRP：辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase）PBST：含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液（Phosphate-BufferedSalinewith0.05%Tween20）PFU：噬斑形成单位（PlaqueFormingUnit） PBST：配制参照附录A.1 青-链霉素：配制参照附录A.2。 维持液：配制参照附录A.3。 培养液：配制参照附录A.4。 覆盖物：配制参照附录A.5。 水：GB/T6682-2008，二级水。 HEp-2 一抗：单克隆抗体Palivizumab 二抗：HRP标记山羊抗人IgG。 TrueBlue显色液。 96孔细胞培养板。 CO2培养箱。 II级生物安全柜。 HEp-2细胞经0.25%的胰酶消化后，用培养液将HEp-2细胞密度调整至2×105个/mL，于375%CO2培养箱培养12h～16h。将HRSV接种于HEp-2细胞，37℃吸附1h后，加入维持液继续培养，逐日观察毒上清，加入等体积的FBS，分装至冻存管（1mL/管），超低温保存备用。 病毒液起始稀释度为1:10（将100μL病毒液加入到900μL维持液中），采用维持液进行10倍倍比稀每个稀释度病毒接种2孔，各吸100μL病毒稀释液加入到相应细胞孔中，同时设置不加病毒稀释液375%CO2培养箱吸附1h200μL覆盖物，于37℃5%CO2培养箱培养40h～48h。小心弃去96孔细胞培养板中的覆盖物，每孔加入200μL4%多聚甲醛，室温固定15min。弃去96孔弃去96孔细胞培养板中的PBST液，每孔加入浓度为0.75μg/mL的单克隆抗体Palivizumab100μL，置于37℃恒温水浴箱内孵育1h。至工作浓度后，每孔加入100μL，置于37℃恒温水浴箱内孵育30min。 ℃取40μL灭活血清加入到120μL维持液中，进行4倍倍比稀释（参照附录B.1）。分别吸取不同稀释于37℃5%CO2培养箱中和2h。弃去96孔细胞培养板中的培养基，取100μL待测血清和病毒中和后的混合液加入到相应细胞孔中，每个稀释度2孔。96孔细胞培养板同时设细胞对照和病毒对照（参照附录B.2）。于37℃5%CO2培养箱吸附1h后吸去接种物，每孔加入200μL覆盖物，于37℃5%CO2培养箱培养40h～48h。小心弃去96孔细胞培养板中的覆盖物，每孔加入200μL4%多聚甲醛，室温固定15min。弃去96孔弃去96孔细胞培养板中的PBST，每孔加入浓度为0.75μg/mL的单克隆抗体Palivizumab100μL，置于37℃恒温水浴箱内孵育1h。至工作浓度后，每孔加入100μL，置于37℃恒温水浴箱内孵育30min。弃去96孔细胞培养板中的二抗，用PBST洗3次，每孔加入TrueBlue30μL，轻轻晃动以确保 对细胞板每个孔进行噬斑计数并记录。病毒对照孔噬斑数量应为20PFU～200PFU之间；未接种病 ( 实验室应遵循GB19489和WS233对生物安全二级实验室的生物安全要求。 个人防护和实验过程中产生的所有废弃物应遵循GB19489的相关规定。

附录即配成含0.05%吐温20的洗涤缓冲液（PBST），4℃保存备用。滤，分装后-20℃保存备用。无菌量取DMEM培养基480mL，加入10mLFBS、5mL7.5%碳酸氢钠溶液、5mL青-℃无菌量取DMEM培养基440mL，加入50mLFBS、5mL7.5%碳酸氢钠溶液、5mL青-℃将2.4g微晶纤维素粉末加入100mL水中，在磁力搅拌器上充分搅拌溶解，121℃高压灭菌3