《烟用添加剂中对乙氧基苯脲的测定高效液相色谱法实验报告》

《烟用添加剂中对乙氧基苯脲的测定高效液相色谱法》

实验报告

云南烟草科学研究院

二○一二年二月九日

1前言

1.1对乙氧基苯脲简介

对乙氧基苯脲（4-Ethoxyphenyl-urea），俗名甘素（dulcin），亦称甘精，是一种人工合

成甜味剂，甜度大约是蔗糖的250倍，1884年被JosephBerlinerbau发现。由于其与糖精钠

相比没有后苦味，7年以后作为人工合成甜味剂进行大批量生产，在20世纪初占有很大的市场，

作为糖尿病患者的代糖。1951年美国FDA对对乙氧基苯脲的安全性提出了质疑，1954年经过

多次的动物实验证明了其能够水解成氨基苯酚而引发肿瘤，从而退出市场。对乙氧基苯脲在人

体中的吸入、分布、代谢及排泄目前并无资料。经动物实验(兔与大鼠)结果显示：三小时內快

速吸收进入血液，但排泄粪便中没有发现代谢物，除了脂肪之外的大部分组织中对乙氧基苯脲

代谢消失都很慢。联合国粮农组织与世界卫生组织（FAO/WHO）建议每日容许摄取量：禁止使

用。世界上大部分国家（美国、日本、中国台湾、中国香港）均禁止食品中使用对乙氧基苯脲。

有研究表明，成人摄入20-40g会头晕、恶心，并可能导致低血压与发绀和高铁血红蛋白血症。

在我国，对乙氧基苯脲不在卫生标准GB2760允许使用的甜味剂名单范围内。据文献报道[1]，常

在蜜饯食品中检验出对乙氧基苯脲的存在。

1.2理化性质

对乙氧基苯脲是酰胺类物质，也是脲中的一类。化学式为C9H12N2O2，CAS号为：150-69-6。

对乙氧基苯脲是具有金属光泽的白色针状晶体，分子量为180.21[2]，熔点：173-174℃，在水

中的溶解度为3.8g/L[3]。可由对乙氧基苯胺盐酸盐和尿素加热反应制得，或者将对氨基苯乙

醚与二氯化碳作用后，再加入氨气而制成[4]。对乙氧基苯脲的分子结构式如下图：

对乙氧基苯脲分子结构式

1.3检测方法综述

目前能够检索到的检测方法主要包括：薄层色谱法、分光光度法、气相色谱法、毛细管电

泳法、液相色谱法，下面就对乙氧基苯脲检测技术发展情况分类介绍如下。

1.3.1薄层色谱法

Kamp.W.等[9]在1966年用薄层色谱技术分离并鉴定了对乙氧基苯脲、甜蜜素和糖精钠。1972

年RyuzoTakeshita[10]利用薄层色谱法检测食品中的甜味剂(糖精钠、甜蜜素和对乙氧基苯脲)，

先用乙酸乙酯提取，硅胶和中性氧化铝柱净化，再经过聚酰胺色谱板分离，方法灵敏度范围

0.01～2μg。

1.3.2分光光度法

1.3.2.1荧光分光光度法

文献报道关于对乙氧基苯脲荧光分光光度检测方法，该类方法是基于增强对乙氧基苯脲荧

光强度展开的一系列工作。UchiyamaS[11]于1969年首次提出了用亚硝酸钠与对乙氧基苯脲作

用，再用荧光分光光度法检测食物中的对乙氧基苯脲。SadaoUchiyama[12]在1972年报道了用

荧光分光光度法测定对乙氧基苯脲与亚硝酸钠反应得到的产物，该方法是在室温条件下，经过

①对乙氧基苯脲与亚硝酸钠和盐酸发生化学反应，②混合的反应产物与氢氧化钠反应这两个步

骤后，用氯仿提取、硅胶柱分离纯化，采用荧光分光光度计检测样品中的对乙氧基苯脲。

SadaoUchiyama[13]1977年具体介绍对乙氧基苯脲与亚硝酸钠的反应条件，如反应的温度，

时间。还提出反应得到的产物的荧光性是对乙氧基苯脲的5倍，明显增强了对乙氧基苯脲的荧

光性，检出限也比之前降低了20倍，用此方法测定苯胺类物质的衍生物，尤其是对位的苯胺

类物质、氨基苯乙醚时，可以提高方法灵敏度。

1.3.2.2紫外可见分光光度法

1983年，M.VeerabhadraRao等[14]将对乙氧基苯脲在6.0molNaOH条件下进行水解，水

解以后的对乙氧基苯脲在pH=3.0条件下被次氯酸钾氧化，然后在pH=10.0的条件下，与酚的

作用下得到靛酚，该衍生物吸收波长为630nm，方法测定的浓度范围为0.5-8.0μg/mL，回

收率达到99.5-100%。

2000年，美国AOAC17th出台了官方方法957.11——规定了食品中对乙氧基苯脲的测定方

法，方法分为快速显色定性方法和紫外分光光度比色定量方法[6，7]两个部分。其中分光光度法

定量检测的对象是非酒精饮料，通过溶剂萃取纯化样品，分光光度计定量测定，检测波长为

294nm。

1.3.3气相色谱法

1971年H.Konig[15]采用气相色谱同时检测糖精、甜蜜素、对乙氧基苯脲。其中糖精和甜蜜

素用重氮甲烷来进行衍生，其中对乙氧基苯脲则不需要衍生化处理，三种物质检出限达到分别

为0.2,0.02和0.02μg/mL。另据报道测定食品中的对乙氧基苯脲的前处理步骤包括：先用水萃

取样品，1N硫酸使之酸化，正己烷除去样品中的脂肪，之后将水萃取液的pH调至11-13，再用

乙醚萃取浓缩至干，并用98%乙腈溶解后进行气相色谱测定。就气相色谱测定对乙氧基苯脲的

方法而言，前处理步骤繁琐，操作复杂、耗时。

1.3.4毛细管电泳法

根据对乙氧基苯脲易离子化的特点[16]，该物质也适用于毛细管电泳检测技术。针对样品疏

水性质的差异，采用胶束电动毛细管色谱(MECC)直接将其分离和检测。

1995年，CatherineO.Thompson[17]用胶束电动毛细管电泳法测定低热量饮料中的几种甜味

剂（阿斯巴甜，糖精钠，安赛蜜，阿力甜和对乙氧基苯脲），用开管毛细管柱，0.05M脱氧胆

酸钠、0.01M磷酸氢二钾、0.01M硼酸钠作为缓冲盐（pH=8.60），方法回收率为104-112%，

精密度达到0.63-2.6%。

2000年，LinYH[18]用毛细管柱,在0.05M脱氧胆酸钠、0.02M硼酸(pH8.6)、5%乙腈组

成的缓冲溶液中，选取20kv分离电压和214nm检测波长条件下，采用胶束电动毛细管电泳

来同时分离和检测蜜饯中对乙氧基苯脲、阿斯巴甜、糖精、安赛蜜和9种防腐剂（山梨酸、苯

甲酸、脱氢乙酸钠、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基和异丁基对羟基苯甲酸），方法平均回

收率达到90%，检出限范围为10-25μg/g。

1.3.5液相色谱法

近年来随着液相色谱的普及和相关技术的发展，使得液相色谱在食品检测领域内得到了迅

速的发展，在检索到的文献中，关于对乙氧基苯脲的液相色谱方法均采用反相高效液相色谱来

检测对乙氧基苯脲，前处理方法由液-液萃取或固相萃取技术组成。

1.3.5.1液相色谱紫外检测法

1999年，Kobayashichigusa[8]等建立了五种甜味剂的液相色谱检测方法，该方法将制备后

样品与0.01mol/L的盐酸含10％氯化钠溶液反应，经过盐酸透析、C18固相萃取柱分离后，采用

甲醇：水=45：55的流动相，完成样品中五种甜味剂（阿力甜、安赛蜜、糖精钠、阿斯巴甜和

对乙氧基苯脲）的检测。

[1]

杨雪娇等用高效液相色谱法测定蜜饯中的对乙氧基苯脲，用SB-C18色谱柱(4.6mm×150

mm,5μm)作固定相，以磷酸二氢钾溶液-乙腈(60+40)为流动相，在240nm波长条件下用二极

管阵列检测器或紫外检测器进行检测。结果显示：线性范围1.0-200.0μg/mL，方法的测定下

限(S/N=3)为0.2μg/mL，加标回收率88.3%-94.0%，相对标准偏差0.0772-2.65。该方法的前

处理步骤为：蜜饯样品去核、粉碎均匀后，称取5-10g置于100mL容量瓶中，加水溶解后，缓

慢加入乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液各5mL除蛋白质，用水定容至刻度，取上清液磁力搅拌30

min后，用干燥滤纸过滤，滤液用0.45μm微孔滤膜过滤。

B.H.Chen[19]在1995年对多种甜味剂（对乙氧基苯脲、糖精钠、安赛蜜），防腐剂（脱氢

乙酸钠、山梨酸、水杨酸、苯甲酸、琥珀酸等）和抗氧化剂（3-叔丁基-4羟基和第三丁基对

苯二酚），-羟基异丁酸和乙腈（2.2:3.4或2.4:3.6）和溴化十六烷基三甲基铵与被测物质

形成离子对作为流动相，选用C18柱，紫外吸收在233nm,检测限范围：0.15-3.00μg。

[20]

M.Veerabhadrarao等人以μBondspakC18为分离柱，甲醇，乙酸，水混合体系（20+5+75）

为流动相，检测波长在254nm可测定咖啡因、对乙氧基苯脲、苯甲酸和香兰素。如将流动相换

为甲醇、乙酸和水的混合体系（35+5+60），可检测阿斯巴甜。误差百分率及相对误差百分率

为：0.3-2.8%，1.64-3.60%。回收率达到91.6-101.8%。

P.W.Wu[21]探讨以高效液相色谱分析饮料中的糖精,安赛蜜,阿斯巴甜和对乙氧基苯脲饮料

经过ODS-4净化器净化以后,使用BondapakC18（3.9mm×300mm,10μm）为分析柱，以磷酸调

节pH=6.0，浓度34mM的TEA-OH，紫外吸收波长在210nm,经过30分钟可以同时检出4种甜味剂，

回收率92.2%以上。

1.3.5.2液相色谱蒸发光散射检测法

蒸发光散射检测器是一种通用型检测器，其最突出的特点是可以对没有紫外、荧光吸收的

物质进行检测，使用该检测器可以不依赖于物质的特征。

2007年AndrzejWasik[22]用高效液相-蒸发光散射检测器法测定饮料中的9种甜味剂（安赛

蜜，甜蜜素，阿力甜，纽糖，对乙氧基苯脲等）,方法检出限<15μg/g,定量限<30μg/g,加

标回收率达到93-109%，精密度<4.0%，线性范围在25-150μg/g之间。该方法的前处理步骤包

括：取5克均质样品至50mL容量瓶，用pH4.5的缓冲溶液（甲酸-三乙胺）溶解稀释至刻度，振

荡超声15分钟，然后以10分钟4000转的转速离心。SPE柱先用3mL甲醇与3×2mL缓冲液先活化，

SPE柱的柱流速为1-2mL/min,取离心后的上清液10mL上至SPE柱床，用3mL缓冲液冲洗杂质，

2×2mL甲醇进行洗脱柱上的样品。

2009年英国颁布了测定食品中9种甜味剂的检测标准[23](标准号：09/30197132DC)，该标

准采用的仪器为液相色谱蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD），标准中样品前处理与AndrzejWasik

所建立的方法基本一致。

1.3.5.3液相色谱质谱检测法

MasamichiKoyama等[24]将食品中的9种甜味剂：安赛蜜、三氯蔗糖、糖精、甜蜜素、阿斯

巴甜、对乙氧基苯脲、甘草酸、甜菊糖、莱鲍迪甙A用HPLC-MS同时进行分离和测定，分离体系

是：ZORBAXEclipseXDB-C18(2.1mm×150mm)柱子，流动相5mMDBAA和乙腈-水（8：2），

质谱模式是负离子（SIM）。安赛蜜、糖精、甜蜜素、阿斯巴甜、甜菊糖的定量限都是0.001g/kg,

三氯蔗糖、甘草酸、对乙氧基苯脲、莱鲍迪甙A是0.005g/kg,精密度在0.5-10.9%之间。

1.4小结

综上所述，检测对乙氧基苯脲的方法种类多样，方法各具特色。其中，气相色谱法测定对

乙氧基苯脲时因为前处理过程需多次有机溶剂提取与萃取，因而影响回收率，特别是固体类的

样品。对于毛细管电泳技术，测定对乙氧基苯脲作为一种具有特色的方法，近年来得到了较好

的发展，但由于该仪器设备的普及性问题，因此此类方法并不是对乙氧基苯脲测定的主流方法，

目前测定对乙氧基苯脲报道较多的方法是液相色谱法。

项目组经过长期的研究和探索，在参考英国标准（食品中9种甜味剂的检测—09/30197132

DC）的基础上，通过验证和比较，最终选用高效液相色谱荧光检测器方法建立了烟用添加剂（香

精和料液）中对乙氧基苯脲的检测标准。

2标准适用范围

本标准规定了烟用添加剂（香精和料液）中对乙氧基苯脲的测定方法——高效液相色谱法；

本标准适用于烟用添加剂（香精和料液）中对乙氧基苯脲的测定。

3原理

烟用添加剂试样采用溶剂振荡萃取，固相萃取柱净化后，经高效液相色谱仪分离，以荧光

检测器测定，外标法定量。

4试验方法

4.1仪器

常用试验仪器及下述各项。

4.1.1高效液相色谱仪，配置柱温箱,具备梯度洗脱功能,荧光检测器。

4.1.2分析天平,感量0.1mg。

4.1.3振荡器，最大转速应大于150r/min。

4.1.4C18固相萃取柱，规格：1000mg/6mL。

4.1.5NH2固相萃取柱，规格：1000mg/6mL。

4.1.6有机滤膜，0.45µm。

4.2试剂和材料

除特殊要求外，均使用分析纯试剂。

4.2.1水，应符合GB/T6682中一级水的要求。

4.2.2甲醇，CH3OH，色谱纯。

4.2.3乙腈，CH3CN，色谱纯。

4.2.4二氯甲烷，CH2Cl2。

4.2.5乙酸，CH3COOH。

4.2.6乙酸铵，CH3COONH4。

4.2.7对乙氧基苯脲，C9H12N2O2（CAS号：150-69-6），纯度＞97%。

4.2.8缓冲溶液，分别称量2.27g乙酸铵（4.2.6）和0.2mL乙酸（4.2.5）至1000mL容量

瓶中，用水（4.2.1）定容至刻度。

4.2.9洗脱溶剂，甲醇/缓冲溶液（4.2.8）混合溶剂，体积比8:2。

4.2.10标准溶液

4.2.10.1一级标准储备液:称取100mg（精确至0.1mg）对乙氧基苯脲(4.2.7)，用甲醇（4.2.2）

溶解转移至100mL容量瓶中，用甲醇（4.2.2）定容至刻度。在2℃～8℃下密闭保存，有效

期1个月。

4.2.10.2二级标准储备液:准确移取5.0mL一级储备液（4.2.10.1）至100mL容量瓶中，用

甲醇（4.2.2）稀释定容至刻度。在2℃～8℃下密闭保存，有效期1个月。

4.2.10.3标准工作溶液:分别准确移取100μL、500μL、1000μL、2000μL、4000μL、

6000μL二级标准储备液（4.2.10.2）至50mL容量瓶中，用洗脱溶剂（4.2.9）定容至刻度，

即配即用。

4.3试样前处理

称取1g（精确至0.1mg）试样于50mL具塞的锥形瓶中，加入15mL水（4.2.1），在

150r/min条件下振荡萃取10min，将振荡萃取液移入25mL具塞容量瓶中，用5mL水（4.2.1）

清洗锥形瓶，将清洗溶液注入容量瓶中，并用水（4.2.1）定容至刻度，取10mL定容后的提

取液至10mL离心试管中在5000r/min条件下离心10min，静置备用。

取C18固相萃取柱，分别用5mL甲醇（4.2.2）和5mL水（4.2.1）进行活化，准确移取

离心上清液5mL上柱，用5mL水（4.2.1）清洗，用6mL洗脱溶剂（4.2.9）洗脱，洗脱液

用洗脱溶剂（4.2.9）定容至10mL。C18固相萃取柱流速为1mL/min～2mL/min。取适量溶液

过0.45μm滤膜（4.1.6），滤液用高效液相色谱仪分析。

对于水不能分散的试样，按照以下方法处理。

称取1g（精确至0.1mg）试样于50mL具塞的锥形瓶中，加入15mL二氯甲烷（4.2.4），

在150r/min条件下振荡萃取10min，将振荡萃取液移入25mL具塞容量瓶中，用5mL二氯

甲烷（4.2.4）清洗锥形瓶，将清洗溶液注入容量瓶中，并用二氯甲烷（4.2.4）定容至刻度，

摇匀，静置备用。

取NH2固相萃取柱，分别用5mL甲醇（4.2.2）和5mL二氯甲烷（4.2.4）进行活化，准

确移取试样提取液5mL上柱，用5mL二氯甲烷（4.2.4）清洗，用6mL洗脱溶剂（4.2.9）

洗脱，洗脱液用洗脱溶剂（4.2.9）定容至10mL。NH2固相萃取柱流速为1mL/min～2mL/min。

取适量溶液过0.45μm滤膜（4.1.6），滤液用高效液相色谱仪分析。

若待测试样溶液的浓度超出标准工作曲线浓度范围，则对试样前处理适当调整后重新测定。

4.4高效液相色谱条件

以下分析条件可供参考，采用其它条件应验证其适用性。

——CAPCELLPAKCR色谱柱：强阳离子交换与反相C18混合填料，混合比例（1:4）；规格：

填料粒径5.0µm，250mm(长度)×4.6mm（内径）；

——流动相A：乙腈(4.2.3)；

——流动相B：缓冲溶液（4.2.8）；

——柱温：35℃；

——流速：1.0mL/min；

——进样体积：10μL；

——梯度洗脱程序见表1；

——荧光检测器检测波长:λex（激发波长）为290nm，λem（发射波长）为325nm。

表1梯度洗脱程序

时间流动相A流动相B

min%%

01585

202575

214060

314060

321585

521585

4.5标准曲线制作

用高效液相色谱测定一系列对乙氧基苯脲标准工作溶液（4.2.10.3），得到6个浓度水平

的对乙氧基苯脲标准物质的液相色谱峰面积。用峰面积作为纵坐标，微克每毫升（μg/mL）计

的对乙氧基苯脲标准物质浓度作为横坐标建立对乙氧基苯脲的标准工作曲线。工作曲线相关数

据见表2，工作曲线见图1。

表2标准工作溶液检测数据

浓度峰面积

µg/mLLU*s

0.10040.14090

0.50200.76195

1.00401.49651

2.00802.98074

4.01606.00373

6.02408.91819

图1标准工作曲线

4.6结果计算

烟用添加剂试样中对乙氧基苯脲含量按式（1）进行计算，

cVf

X=i……（1）

m

式中

X——试样中对乙氧基苯脲含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；

ci——标准曲线计算所得对乙氧基苯脲的浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；

V——萃取溶液体积，单位为毫升(mL)；

ƒ——稀释系数（ƒ＝2）；

m——试样质量，单位为克(g)。

取两次平行测定结果的算术平均值作为试样测定结果，精确至0.01毫克每千克（mg/kg）。

两次平行测定结果的相对平均偏差应不大于10％。

5结果与讨论

5.1色谱条件的选择

5.1.1检测器及波长的选择

5.1.1.1检测器

在液相色谱检测对乙氧基苯脲的相关文献中，所采用的检测器包括：蒸发光散射、荧光和

紫外检测器等三种，其中蒸发光散射检测器是英国标准（食品中9种甜味剂的检测—

09/30197132DC）选取的检测器，该检测器是一种通用型检测器，对于同时检测多种成分具有

一定的优势。紫外和荧光检测器则是基于目标物质的紫外和荧光光谱特性而广泛应用的检测

器。

项目组采用标准品进行了荧光和紫外光谱扫描，荧光激发和发射光谱图见图2、紫外吸收

光谱图见图3。

图2对乙氧基苯脲荧光激发和发射波长光谱图

图3对乙氧基苯脲紫外吸收光谱图

从图2、图3光谱扫描结果表明：对乙氧基苯脲具有紫外吸收，同时也具备荧光特性，因

此项目组分别对蒸发光散射检测器、荧光检测器和紫外检测器三种检测器进行考察，检测器考

察结果如下：

1检测器的检出限

紫外检测器：0.02µg/mL

荧光检测器：0.04µg/mL

蒸发光散射检测器：4µg/mL

2检测器的稳定性和普适性分析

项目组根据实际操作情况，经过长期试验形成以下判断：

从检测器稳定性分析，三种检测器从高到低排序为：紫外≥荧光＞蒸发光散射。对于蒸发

光散射检测器（ELSD）来说，由于使用了高纯氮气作为载气，做日间重复性试验时样品的检测

信号强度偏差较大，这就使得每批次测定样品时都必须重做标准曲线，而且测定结果的相对标

准偏差较大。与紫外、荧光这两种检测器相比，蒸发光散射检测器使用起来工作量相对较大。

从检测器操作的简便性分析，三种检测器从高到低排序为：紫外=荧光＞蒸发光散射。

从检测器普及程度分析，三种检测器从高到低排序为：紫外=荧光＞蒸发光散射。

3检测器综合分析

对于蒸发光散射检测器（ELSD）而言，项目组通过大量试样加标的方式进行对乙氧基苯脲

测定，结果表明：该检测器灵敏度低，重复性较差。根据检测器的选择性和检出限具体数值分

析，检出限约为4µg/mL（理论计算数值），按本标准制订的前处理稀释比例折算为方法检出限

为200mg/kg。烟草行业内部对16种禁用成分之一香豆素在香精和料液中限量值规定是150

mg/kg，低于蒸发光检测器的检出限。对于添加剂中对乙氧基苯脲限量，项目组也参照香豆素

在香精和料液中限量值（150mg/kg），那么在现有前处理条件下，该方法则无法满足限量判断

的要求。如果进一步优化HPLC-ELSD方法，减小稀释倍数，也可以降低方法检出限，满足限量

判断的要求。但是如果需要进一步降低限量数值，则该方法又会存在难以支撑限量判断的问题。

检出限高的实际情况表现见图4，图4是浓度为10µg/mL的加标试样的高效液相色谱蒸发光检

测器方法色谱图。

目标峰

图4对乙氧基苯脲蒸发光检测器色谱图

从图4可以看出：即使在10µg/mL的浓度水平情况下，试样采用蒸发光散射检测器也很

难达到准确检测的目的。同时基于检测器的稳定性和普适性等方面的考虑，项目组否定了蒸发

光散射检测器作为液相色谱检测器的选择。

通过试样加标的方式，分别对紫外（最大吸收波长—240nm）和荧光（检测波长—

λex/λem=290/325nm）两种检测器进行了考察。结果见图5、图6。

图5加标试样（常规）UV和FLD典型色谱图

图6加标试样（特殊）UV和FLD色谱图

从色谱图5可以看出，对常规试样而言，紫外检测器和荧光检测器都可以检测到目标物质

（见图5），但是增大实际试样考察发现：紫外检测器检测特殊样品时，干扰物质影响检测结果。

图6是代表性样品检测色谱图，从该色谱图中可以看出：目标物质与干扰物质难以达到完全分

离的效果。由于香精及料液成分较为复杂、种类繁多，具备紫外吸收的物质众多，采用对乙氧

基苯脲的紫外特征吸收波长（240nm）易出现假阳性结果，因此项目组否定了紫外检测器作为

液相色谱检测器的选择。

而荧光检测器，由于其具有较高的选择性，因此对于项目组所收集到的试样均能达到准确

检测的目的。所以，对于种类繁多的添加剂试样而言，项目组选用了具有较高选择性的荧光检

测器作为对乙氧基苯脲试样检测的技术手段。

5.1.1.2检测波长

项目组根据荧光激发光谱和发射光谱，遵循最大△值原则，选择了λex/λem=239/312nm

作为检测波长，但是在进行试样普查试验过程中，出现了大量阳性检测结果。通过排查发现：

在对乙氧基苯脲出峰位置有干扰峰存在，并且通过比较证明该干扰峰是由前处理溶剂甲醇引

入。为了确证这一问题，项目组分别取可能在试样前处理和试样中含有的试剂：甲醇、乙醇、

丙二醇进样检测，结果发现：在目标峰位置均出现了干扰峰，结果见图7。

为了消除甲醇、乙醇、丙二醇对试样检测结果的影响，项目组根据扫描的荧光光谱图，将

检测波长改变为：λex/λem=290/325nm，试样检测结果发现干扰峰消失，结果见图8。

图7λex/λem=239/312nm荧光色谱图

图8λex/λem=290/325nm荧光色谱图

由于烟用添加剂中常用到乙醇、丙二醇等醇类物质，且试样前处理过程中会用到甲醇，所

以项目组根据上述试验结果，选择采用λex/λem=290/325nm作为高效液相色谱方法的检测波

长。

5.1.2色谱柱的选择

项目组根据文献报道，考察了三种不同特性的色谱柱对代表性加标试样的分离效果，三种

色谱柱包括：①ZorbaxExtend-C18（5μm,250×3.0mm）(pH值适用范围：2.0～11.5，该

色谱柱为英国标准—09/30197132DC中可选用的色谱柱)；②ZorbaxSBC18（3.5μm,250×4.6

mm）(pH值适用范围：1.0～8.0）；③CAPCELLPAKCR1:4（5.0µm,250×4.6mm）(pH值适

用范围：1.5～10.0）。结果见图9、图10、图11。

图9ZorbaxExtend-C18（5μm,250×3.0mm）普通样品色谱图

图10ZorbaxSBC18（3.5μm,250×4.6mm）普通样品色谱图

图11CAPCELLPAKCR1:4（5.0µm,250×4.6mm）普通样品色谱图

通过对大量试样筛查，对于多数试样而言这三种色谱柱都可以达到检测要求，但对于一些

较为复杂的试样，则CAPCELLPAKCR1:4（5.0µm,250×4.6mm）色谱柱具有最优的分离

效果。结果见图12、图13、图14。

图12ZorbaxExtend-C18（5μm,250×3.0mm）复杂样品色谱图

图13ZorbaxSBC18（3.5μm,250×4.6mm）复杂样品色谱图

图14CAPCELLPAKCR1:4（5.0µm,250×4.6mm）复杂样品色谱图

从图12、图13、图14可以看出，对于复杂样品而言，三种色谱柱分离能力比较表明：

CAPCELLPAKCR1:4（5.0µm,250×4.6mm）色谱柱的分离能力最强。所以项目组选择CAPCELL

PAKCR1:4（5.0µm,250×4.6mm）色谱柱进行试验。

5.1.3流动相的选择

在确定分析柱（CAPCELLPAKCR1:4，5.0µm,250mm×4.6mm）后，项目组根据所确定的

分析柱使用特性，考察了流动相中缓冲液在不同pH值条件下对分离效果的影响，影响情况用

分离度R来比较。

对于普通样品而言，由于组分简单，pH值对分离效果的影响不明显，为了提高方法的普适

性，项目组特别针对复杂的香精及料液样品开展流动相pH值考察。具体考察方法为：选择了

香料烟浸膏和秘鲁浸膏两个样品，在完成加标步骤后，按照标准规定的前处理方法进行了样品

制备，在流动相pH值分别为：4.08、5.06、6.04、6.40的条件下进行样品检测，结果见图15、

图16、图17、图18。

图15加标样品pH=4.08色谱图

图16pH=5.06色谱图

图17pH=6.04色谱图

图18pH=6.40色谱图

试验结果表明：对于较为复杂性试样，pH=6.04的缓冲液的分离度最大，同时采用该条件

对普通样品进行验证，实验结果表明该条件同样适用（见图19），项目组最终选择pH=6.04的

缓冲液作为标准方法流动相pH条件。

图19pH=6.04普通样品色谱图

5.1.4其它色谱条件的选择

5.1.4.1色谱梯度及流速

在确定色谱柱和流动相之后，项目组对液相色谱梯度和流速进行了优化，获得了标准中所

列的推荐色谱梯度，具体色谱梯度见表1，色谱流速见色谱条件（4.4）。

5.1.4.2色谱柱温度

在液相色谱分析中，色谱柱应在稳定的温度下工作。项目组分别试验了温度为25℃、30℃、

35℃、40℃，发现对试样测定结果影响不大。本标准选用35℃为工作温度，在此工作温度

下，色谱柱分离效果稳定。

5.1.4.3色谱柱进样体积

在液相色谱分析中，大的进样体积有利于提高检测灵敏度，但容易造成峰脱尾、分离度变

差，小的进样体积则存在分析结果不稳定等现象，项目组比较了不同进样体积对色谱峰的影响，

结果表明进样体积为5～15µL时，均能得到分离状况良好、重现性较好的色谱图，本标准采

用10µL为进样体积。

5.2前处理步骤选择及优化

5.2.1空白试验

不加样品，重复样品前处理步骤，进行高效液相色谱分析。检测结果未检出对乙氧基苯脲。

因此在标准方法中，不需要进行空白试验以及不需要进行空白扣除。

5.2.2样品提取溶剂选择

根据文献报道，对乙氧基苯脲在水中理论溶解度是3.8g/L,从甜味剂功能性添加（替代蔗

糖）的角度分析，烟用添加剂中含糖量最高的试样是糖料，一般含25%的蔗糖。对于1g试样

而言,最大蔗糖含量为0.25g，如果全部用对乙氧基苯脲代替，根据对乙氧基苯脲和蔗糖的甜

度比为1:250进行折算，对乙氧基苯脲最大添加量为0.001g,0.001g对乙氧基苯脲被25mL

（提取液定容体积）水分散定容后浓度为40µg/mL，即可能的功能性最大添加浓度是40mg/L。

这就意味着：如果违规添加了对乙氧基苯脲，检测试样中对乙氧基苯脲浓度也大大低于对乙氧

基苯脲在水中理论溶解度，因此可以选用水作为萃取溶剂提取水溶性香精及料液试样中的对乙

氧基苯脲。

同时，项目在制订本标准的同时，在综合考虑对乙氧基苯脲物化特性、样品分散性、样品

萃取和样品净化等诸多方面因素的情况下，参考“甜蜜素的测定”行业标准，选取样品分类处

理的办法。也就是将样品分为水溶性样品（采用水作为分散溶剂）和非水溶性样品（采用二氯

甲烷作为分散溶剂）。样品分类后，在制订标准前处理方法时，可以根据不同类型的样品采取

更为科学合理的提取和净化手段，从而保证了样品检测的准确性和稳定性。

5.2.3净化步骤的选择

项目组考察了用固相萃取柱净化与不净化对试样分离效果的影响，对大多数简单试样净化

与不净化对结果影响区别不大，但对于复杂试样净化后的结果则十分明显。结果见图20、图

21。

图20香料烟浸膏不净化与净化色谱图

图21秘鲁浸膏不净化与净化色谱图

试验结果表明：没有用固相萃取柱净化的复杂试样目标峰与干扰成分之间无法做到完全分

离，而用固相萃取柱净化后试样的分离效果有了明显的改善。项目组选择在前处理过程中增加

固相萃取柱净化这个步骤。

5.2.4固相萃取条件选择及优化

5.2.4.1清洗溶剂的选择

本标准采用样品分类处理方法，为样品分散、样品净化手段的应用提供了更多的选择。项

目组参考了英国HPLC-ELSD测定食品中9中甜味剂的检测标准(标准号：09/30197132DC)，选

用了C18固相萃取柱（规格：1000mg/6mL）作为水溶性样品的净化手段。同时项目组通过大量

文献调研和实验摸索，选取了NH2固相萃取柱（规格：1000mg/6mL）作为非水溶性样品的净

化手段。根据C18固相萃取柱和NH2固相萃取柱使用特点，选择了与提起溶剂相匹配的试剂作

为固相萃取柱的清洗剂。具体而言：水溶性样品在采用C18固相萃取柱进行净化的过程选用水

作为清洗剂；非水溶性样品在采用NH2固相萃取柱进行净化的过程选用二氯甲烷作为清洗剂。

5.2.4.2洗脱溶剂的选择

项目组参考英国HPLC-ELSD测定食品中9中甜味剂的检测标准(标准号：09/30197132DC)，

考虑到液相色谱检测时标准工作溶液的溶剂环境、样品可比性等因素，项目组在比较试验的基

础上，最终确定统一采用甲醇/缓冲溶液混合溶剂作为C18固相萃取柱和NH2固相萃取柱的洗脱

溶剂。

通过对试样进行加标试验，确定试样洗脱溶剂比例。除洗脱溶剂比例因素外，其他前处理

按照标准前处理步骤执行，其中表香样品和料液等水性样品采用水溶性样品处理步骤，橡苔浸

膏等脂溶性试样采用非水溶性样品处理步骤，试验结果见表3。

表3洗脱溶剂的选择

试样加标浓度洗脱溶剂混合比例实测浓度加标回收率

mg/kg（V甲醇：V缓冲液）mg/kg%

10:048.3296.83

8:248.2596.69

6:445.7891.74

表香49.90

4:633.3466.81

2:8————

0:10————

10:048.3496.26

8:248.2996.16

6:446.5392.65

料液50.22

4:635.6070.89

2:8————

0:10————

10:049.4396.86

8:249.1796.36

6:446.2590.63

橡苔浸膏51.03

4:647.2692.61

2:833.1464.94

0:109.4418.50

通过试验，确定两种固相萃取柱洗脱溶剂均采用：甲醇:缓冲液=8:2（v/v）。

5.2.5净化过程的回收率考察

项目组按照标准前处理步骤中的净化步骤处理三个不同浓度水平的标品，考察分别采用两

种固相萃取柱净化后的回收率，结果见表4。

表4净化过程的回收率考察

加标浓度实测浓度回收率

固相萃取柱

µg/mLµg/mL%

0.20080.22108.65

C柱

181.00401.02101.35

4.01603.9598.40

0.20080.1994.62

NH2柱1.00400.9998.96

4.01603.8796.32

*表4中，采用标准溶液加入到水和二氯甲烷溶剂中后，上柱净化，洗脱液采用标准方法进行检测。试样没有样品称样量数据，

因此计算回收率的输入数据为体积浓度。

从表4可以看出：采用固相萃取柱净化后，标品的回收率在94.62～108.65之间，说明本

净化过程是可行的，用6mL洗脱液能够充分将目标物质从固相萃取柱上洗脱下来。

5.2.6其他前处理条件的选择

5.2.6.1称样量

项目组考察了不同称样量的加标试样，检测结果见图22

图22称样量的选择

通过试验发现：采用不同称样量时，样品实测浓度的相对标准偏差分别为：表香1.03%、

料液0.86%、橡苔浸膏1.06%，该数据表明不同称样量对结果影响差别不大，项目组选择：1g

为称样量。

5.2.6.2萃取体积

通过试验发现：对同一个试样而言，采用10mL、15mL、20mL、25mL、30mL萃取溶剂

萃取加标试样，能够获得具有一致性和稳定性的检测结果。项目组最终采用25mL作为萃取体

积。

5.2.6.3萃取方式

项目组考察了超声和振荡两种萃取方式对加标试样检测结果的影响，检测结果见图23。

图23萃取方式的选择

上述检测结果表明：采用两种萃取方式时，样品实测浓度的相对平均偏差分别为：表香

0.65%、料液1.16%、橡苔浸膏1.37%，该数据表明这两种萃取方式对结果影响差别不大，项目

组选择：振荡萃取的方式。

5.2.6.4萃取时间

项目组考察了不同萃取时间对检测结果的影响，检测结果趋势见图24。

图24萃取时间的选择

采用不同萃取时间时，样品实测浓度的相对标准偏差分别为：表香0.54%、料液0.93%、

橡苔浸膏0.67%，该数据表明不同的萃取时间对结果影响差别不大，项目组选择：10min为萃

取时间。

5.3方法评价

5.3.1检出限和定量限

项目组用逐级稀释的方法找出仪器能检出的标准溶液的最低浓度。浓度值确定为0.0402

µg/mL,项目组还考察了更低浓度0.0301µg/mL，结果见图25。

图250.0301µg/mL的标品色谱图

从图25可以看出：目标峰峰高未达到三倍信噪比，所以项目组采用0.0402µg/mL作为最

低浓度。

最小浓度标准溶液10次进样,计算最低浓度检测结果的标准偏差（α），α=0.0028µg/mL，

3α=0.0084µg/mL；代入公式（1）计算出，检出限：0.42mg/kg；（选取m=1.0000g，V=25

mL）；定量限：1.40mg/kg（计算过程详见附件一）。

5.3.2精密度

分别对同一表香、料液和橡苔浸膏加标试样连续进样10次，计算其测定结果的相对标准

偏差，结果见表5。

表5精密度试验

表香料液橡苔浸膏

实测浓度相对标准偏差实测浓度相对标准偏差实测浓度相对标准偏差

mg/kg%mg/kg%mg/kg%

48.2047.7348.60

48.6547.8248.73

48.0047.9348.30

48.5148.4748.43

48.1846.9047.85

1.161.411.08

49.4847.5447.13

48.1548.4547.68

47.8148.5147.52

47.8748.5548.40

49.1846.6648.07

试验结果表明，表香、料液和橡苔浸膏加标试样的相对标准偏差分别为1.16%、1.41%和

1.08%。说明本方法测定对乙氧基苯脲的精密度良好。

5.3.3重复性

为了考察整个方法的重复性，应用所建立的对乙氧基苯脲测定方法对试样进行日内和日间

加标平行测定，日内表香、料液和橡苔浸膏试样各平行处理5份，日间各连续处理5天，结果

见表6和表7。

表6日内重复性试验

试样加标浓度实测浓度实测浓度相对标准偏差

mg/kgmg/kg%

50.55

50.45

表香49.730.82

50.44

50.43

49.55

46.96

48.38

料液49.4648.361.48

48.81

48.44

49.19

47.40

橡苔

50.4147.721.49

浸膏

47.83

47.57

表7日间重复性试验

试样检测天数加标浓度实测浓度实测浓度相对标准偏差

天mg/kgmg/kg%

147.72

246.85

表香349.8046.961.38

448.17

548.24

147.49

248.05

料液349.6649.091.41

448.83

548.94

147.75

248.05

橡苔

347.4248.61.63

浸膏

447.27

549.31

同一试样同一天内平行处理5份和连续5天重复处理测定结果的相对标准偏差均在5％以

内，说明本方法很稳定，重复性好。

5.3.4储备液稳定性

表8标准储备液在标准储存条件下的稳定性试验

0天7天14天21天30天40天RSD

名称

μg/mLμg/mLμg/mLμg/mLμg/mLμg/mL%

一级标准储备液1.081.081.071.061.051.022.15

二级标准储备液1.081.081.061.051.030.993.27

图26标准储备液稳定性趋势图

从表8和图26可以看出，标准储备液在标准储备条件下30天内的稳定性较好，所以项目

组采用标准储备液的储存条件为：在2℃～8℃下密闭保存，有效期1个月。

5.3.5试样稳定性

把不同浓度的同一表香、料液橡苔浸膏加标试样常温下保存，放置不同时间后进行测定，

其结果见表9和表10、表11。

表9稳定性试验（表香加标试样）

放置时间水平1实测浓度水平2实测浓度水平3实测浓度

hmg/kgmg/kgmg/kg

023.1847.3495.81

1223.2346.9395.91

2423.8347.1899.79

3624.9650.38101.81

4822.4745.5195.22

7222.3346.8195.45

相对标准偏差

4.153.412.85

%

表10稳定性试验（料液加标试样）

放置时间水平1实测浓度水平2实测浓度水平3实测浓度

hmg/kgmg/kgmg/kg

023.7952.92106.93

1224.4352.65108.41

2423.7849.33110.10

3623.5652.94109.47

4822.1951.25106.62

7222.1250.60