高三生物学一轮复习课件51基因工程的基本工具和操作程序

SHENGWUXUE基因工程的基本工具和操作程序课标要求1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。命题点一重组DNA技术的基本工具1.基因工程的概念[认知觉醒]

基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。下列关于基因工程的叙述，错误的有________。①基因工程的原理是基因突变②从操作层面看，基因工程是在细胞水平上进行设计和施工的③基因工程能克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传性状④基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的①②2.基因工程的工具[认知觉醒]

EcoRⅠ限制酶的识别序列和切割位点为5′－G↓AATTC－3′，SmaⅠ限制酶的识别序列和切割位点为5′－CCC↓GGG－3′。下列关于限制酶(限制性内切核酸酶)的叙述，正确的是________。①限制酶只存在于原核生物中②限制酶能识别DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开③EcoRⅠ限制酶切割DNA分子后形成平末端④SmaⅠ限制酶切割DNA分子后形成黏性末端⑤EcoRⅠ限制酶是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶②⑤

1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够将两个DNA片段连接起来的酶，称之为DNA连接酶。下列关于DNA连接酶的叙述，错误的有__________。①DNA连接酶催化磷酸二酯键的断裂②T4DNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段③E.coliDNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端④T4DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于E.coliDNA连接酶⑤DNA连接酶与DNA聚合酶是同一种酶，作用相同①②④⑤思维升华①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。

基因工程中的载体，能携带外源DNA片段进入受体细胞，被称为“分子运输车”。(1)基因工程中通常是利用________作为载体，将基因送入细胞。除此以外，常用的载体还有________________________等。(2)作为基因工程的载体，应满足哪些主要条件？①能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；②有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中；③有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。质粒噬菌体、动植物病毒题型1基因工程的两大工具酶(科学思维)[例1]

(2025·福建厦门模拟)下表为四种限制酶所识别的核苷酸序列及相应的切割位置(箭头所指)，下列叙述正确的是(

)限制酶种类序列及切点限制酶种类序列及切点①EcoRⅠ③BglⅡ②BamHⅠ④NotⅠA.①②③④可催化磷酸二酯键和氢键断裂，形成黏性末端B.①切出的DNA片段，只有用E.coliDNA连接酶才能连接起来C.②③切出的末端连接后形成的片段，不能再被②或③识别切割D.构建基因表达载体时，用②③进行双酶切，可防止目的基因与载体的反向连接C1.根据限制酶切割位点的位置确定限制酶的种类(1)应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。(2)不能选择切割位点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择SmaⅠ。(3)为避免目的基因和质粒的自身环化及随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。2.根据质粒的特点确定限制酶的种类3.根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下：D题型2载体的作用及特点(科学思维)[例2]

(2025·广东广州模拟)下列有关基因工程中载体的说法，正确的是(

)A.在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒B.所有的质粒都可以作为基因工程中的载体C.质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子D.作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因D[例3]

(2025·福建泉州模拟)质粒是基因工程中常用的一种载体。下列关于质粒的说法，错误的是(

)A.质粒中的嘌呤碱基数和嘧啶碱基数是相等的B.一些质粒可以整合到目的细胞的染色体上，随受体DNA同步复制C.可以利用质粒上的特殊标记基因对目的基因进行筛选D.质粒至少应有三个限制酶识别切割位点，便于目的基因插入命题点二基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取[认知觉醒]

利用PCR技术获取和扩增目的基因是基因工程中获取目的基因的重要方法之一，其每个循环的过程如下图所示。(1)PCR技术的原理是__________________。(2)变性时，需要将温度升高到________℃以上，目的是破坏模板DNA分子之间的________，使模板双链DNA解聚成________。(3)复性时，温度下降到________℃左右，目的是让____________通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(4)延伸时，需要将温度上升到________℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在____________________酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。DNA半保留复制90氢键单链50两种引物72耐高温的DNA聚合[深度思考]

(1)在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，其有何作用？既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。(2)为扩增目的基因，应选择下图所示引物中的________________________。引物Ⅱ和引物Ⅲ(3)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图)，请分别说明理由。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效①第1组：

______________________________________________；②第2组：

_________________________________________________。引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效(4)若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第n轮循环需要消耗多少个引物数？经过n轮循环需要消耗引物数为(2n＋1－2)个，第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。思维升华体内DNA复制与PCR技术的比较

PCR技术体内DNA复制相同点原则碱基互补配对条件DNA母链作为模板、引物(体内引物RNA、体外引物DNA)、4种脱氧核苷酸为原料延伸方向新链都是从5′端向3′端延伸不同点解旋方式90℃以上高温解旋解旋酶催化场所PCR扩增仪主要在细胞核延伸用酶耐高温的DNA聚合酶DNA聚合酶温度控制温度、需要在不同温度下进行细胞内温和条件过程结果大量的DNA片段(或目的基因)形成完整的子代DNA2.基因表达载体的构建——核心[认知觉醒]

构建基因表达载体是基因工程的核心工作。如图表示基因表达载体的一般构成，请回答问题：(1)构建基因表达载体的目的是什么？使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时使目的基因能够表达和发挥作用。(2)启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的________游，紧挨转录的起始位点，它是________________识别和结合的部位。上RNA聚合酶(3)构建因表达载体的过程分为酶切和连接两个步骤。下图为构建基因表达载体时所用的载体及目的基因所在DNA片段上限制酶的识别切割位点情况。①构建基因表达载体时________(“能”或“不能”)选择EcoRⅠ，原因是________________________________。不能EcoRⅠ会破坏目的基因②选择SpeⅠ进行单酶切构建基因表达载体时，容易出现目的基因和载体的自身环化，以及目的基因的反向链接，导致目的基因转录时________出现错误，无法表达正常的蛋白质。模板链③选择BamHⅠ与BglⅡ进行双酶切构建基因表达载体时，能否避免单酶切时出现的目的基因和载体的自身环化，以及目的基因的反向链接？为什么？不能，因为BamHⅠ与BglⅡ虽然识别序列不同，但是切割后产生的黏性末端相同。④选择BamHⅠ与HindⅢ进行双酶切构建基因表达载体时，能否避免单酶切时出现的目的基因和载体的自身环化，以及目的基因的反向链接？为什么？能，因为BamHⅠ与HindⅢ切割后产生的黏性末端不同。思维升华关于同尾酶及切割连接不同种限制性内切核酸酶识别序列各不相同，但切割后能产生相同的黏性末端，则称为同尾酶。如BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、Sau3AⅠ、XhoⅡ为一组同尾酶，它们的识别序列和切割位点依次分别是5′－G↓GATCC－3′、5′－T↓GATCA－3′、5′－A↓GATCT－3′、5′－↓GATC－3′、5′－R↓GATCY－3′，它们切割DNA后都形成由GATC组成的黏性末端。由同尾酶酶切产生的DNA片段，能够通过黏性末端的互补作用而彼此连接起来。一般情况下，同尾酶产生的黏性末端连接后不能再被原来的限制酶切割，这是因为同尾酶产生的黏性末端连接后原来的酶切位点将不复存在，故不能被原来的限制酶切割，但可以被识别序列短的限制酶切割，如被上述Sau3AⅠ识别并切割。3.将目的基因导入受体细胞[认知觉醒]

将构建好的基因表达载体导入不同受体细胞，往往采取不同的方法。(1)将基因表达载体导入植物细胞，常常采用________________法或________________法。(2)将基因表达载体导入动物细胞，受体细胞通常是动物________，一般采用____________法。(3)将基因表达载体导入原核细胞时，应用最为广泛的受体细胞是____________，一般先用________处理受体细胞，使其处于一种______________________________的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。花粉管通道农杆菌转化受精卵显微注射大肠杆菌Ca2＋能吸收周围环境中DNA分子(1)农杆菌特点①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。(2)农杆菌转化法中的两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。(3)导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。

4.目的基因的检测与鉴定[认知觉醒]

目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，还需要进行检测与鉴定。(1)分子水平的检测，通常借助________等技术，检测受体染色体DNA上是否插入目的基因或目的基因是否________________；从转基因生物体内提取出相关蛋白质，用相应的抗体进行____________________，检测目的基因是否翻译出相应的蛋白质。(2)________________水平的鉴定，通过抗虫、抗病接种实验，检测转基因生物是否赋予了相关的遗传特性以及这种特性的程度。PCR转录出mRNA抗原—抗体杂交个体生物学题型

基因工程的基本步骤(科学思维)[例1]

(2023·湖北卷，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(

)DA.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落[例2]

(2024·江苏卷，23)为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD)，科研人员将ELP50片段插入pET－SOD构建重组质粒pET－SOD－ELP50，以融合表达SOD－ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列－(GTTCCTGGTGTTGGC)50－限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：图1(1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是___________________。(2)步骤②转化时，科研人员常用________处理大肠杆菌，使细胞处于感受态，转化后的大肠杆菌采用含有_________的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET－SOD－ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是_________________。

图1EcoRⅠ、HindⅢCaCl2卡那霉素S－F和E－R(3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与________结合，驱动转录，翻译SOD－ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是________(从图2的“A～D”中选填)。图2启动子C(4)步骤④为探寻高效纯化SOD－ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD－ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。

①20℃时，加入NaCl后实验结果是_____________________________________。②100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是_______________________________。③据图分析，融合表达SOD－ELP50蛋白的优点有________________________________________________________________。

图3SOD－ELP50组纯化蛋白含量比SOD组高高温使蛋白变性，离心后沉淀

纯化回收率高、杂蛋白少、低温下纯化有利于酶活性的保持

关键·真题必刷1.(2023·重庆卷，12)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基，短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(如下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(

)BA.实验所用引物，其中一个序列为5′－TGCGCAGT－3′B.步骤①所用酶是SpeⅠ和CfoⅠC.用步骤①的酶对载体进行酶切至少获得了2个片段D.酶切片段和载体连接时可使用E.coliDNA连接酶或T4DNA连接酶2.(2024·重庆卷，19)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。①表达载体限制酶识别位点(HindⅢ，SpeⅠ，EcoRⅠ，XbaⅠ)②启动子D＋基因S5′C……TAGAATTCCA……3′3′……ATCTTAA