化学酶工程与生物酶工程课件

化学酶工程与生物酶工程

天然酶在应用中的限制因素酶的活性不够高；酶稳定性较差；可能具有抗原性改变酶特性的方法通过分子修饰的方法来改变已分离出来的酶的天然结构通过生物工程的方法改造编码酶分子的基因从而达到改造酶的目的

酶分子改造的主要目标化学酶工程

天然酶

固定化酶

化学修饰酶(chemicalmodification)

人工模拟酶生物酶工程

克隆酶

突变酶

新酶酶分子改造什么是化学酶工程(primaryenzymeengineering)？化学酶工程primaryenzymeengineering

酶的分离与提纯、化学修饰、酶的固定化、人工酶的合成

工业：食品、纺织、制药科研与医学酶源：微生物、动植物化学与高分子技术7.1化学酶工程自然酶的开发应用酶分子常见修饰方法及注意事项酶的固定化人工酶的研制自然酶的开发应用自然酶的来源?自然酶的开发，必须考虑酶源丰富，应用前景广阔的原则。目前工业上应用的酶制剂，主要集中在食品工业。酶的结构基础

辅因子

催化基团全酶

接触残基

活性部位

底物结合基团

必需残基

辅助残基

酶蛋白

结构残基

非贡献残基7.1.1酶分子化学修饰ActivesiteTheactivesiteistheregionoftheenzymethatbindsthesubstrate,toformanenzyme-substratecomplex,andtransformsitintoproduct.Theactivesiteisathree-dimensionalentity,oftenacleftorcreviceonthesurfaceoftheprotein,inwhichthesubstrateisboundbymultipleweakinteractions.酶分子化学修饰定义

通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结构发生改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程。酶分子化学修饰的目的?如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性如何保护酶活性部位与抗抑制剂如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境酶化学修饰的原理酶分子修饰的意义提高酶的活力activity增强酶的稳定性stability降低或消除酶的抗原性immunologicalproperty研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响structure酶分子化学修饰方法⑴大分子结合修饰⑵酶蛋白侧链基团修饰⑶酶分子内或分子间的交联⑷金属离子置换修饰⑸肽链有限水解修饰⑹氨基酸置换修饰⑺物理修饰定义：通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。常用于酶分子修饰的是二价金属离子此法只适用于本来在结构中含金属离子的酶。⑴金属离子置换修饰通常的操作方法

酶液加入EDTA透析或超滤加入不同的金属离子置换后结果酶活性降低或完全失活酶活性提高或稳定性增加何谓金属离子置换修饰？方法步骤？主要的应用？(2)酶的大分子修饰使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。非共价修饰用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍共价修饰大分子修饰(共价)的过程修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。⑵大分子结合修饰PEG是一种两亲（亲水又亲有机溶剂）性高分子化合物，以HO（CH2－CH2－O）式。经此法修饰可达到如下效果：提高酶活力增加酶的稳定性降低或消除抗原性酶

半衰期相对稳定性

天然SOD6min1

右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)–SOD14h140Ficoll(高分子量)–SOD24h240

聚乙二醇-SOD35h350(3)酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰)利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。如：胃蛋白酶原的激活

对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力。

经常被修饰的残基是： 亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His 亲电的Tyr、Trp对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现氨基酸的取代。此处指用小分子化合物对酶蛋白侧链基团进行修饰。可引起副键的改变，使酶分子空间结构发生某些改变，从而引起酶的特性和功能的改变。⑷酶蛋白侧链基团修饰常用的修饰剂氨基修饰剂二硝基氟苯、醋酸酐、二硫化碳、O-甲基异脲等。作用：产生脱氨基或共价结合将其屏蔽。羧基修饰剂乙醇-盐酸、碳化二亚胺等。作用：使羧基酯化、酰基化或结合生成其他物质。胍基修饰剂二羰基化合物：环已二酮、乙二醛、苯乙二醛等。作用：与胍基缩合生成稳定的杂环。巯基修饰剂二硫苏糖醇、巯基乙醇等还原剂及酰化、烷化剂。作用：与巯基反应，破坏二硫键。咪唑基的化学修饰吲哚基的化学修饰酚基修饰剂四硝基甲烷等。作用：使酚基碘化、硝化或琥珀酰化。甲硫氨酸残基分子内交联剂双功能试剂：二氨基丁烷、戊二醛、已二胺等。作用：与酶分子内两个侧链基团反应，在分子内共价交联。常见基团的化学修饰反应：氨基常见基团的化学修饰反应：羧基常见基团的化学修饰反应：巯基常见基团的化学修饰反应：咪唑基常见基团的化学修饰反应：胍基常见基团的化学修饰反应：色氨酸吲哚基常见基团的化学修饰反应：酚羟基甲硫氨酸甲硫基的修饰⑸变性诱导构象重建变性诱导构象重建与化学修饰区别原理酶的变性、复性实验特定条件下复性（非天然条件或有底物类似物、抑制剂等存在），酶将折叠成所需的特殊结构，产生新的性状。前沿：Keyes实验室的“BIO-SYN-CATTM”技术，包括三个基本环节：微扰；诱导和修饰；交联⑹物理修饰定义？特点？例子？通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。⑺氨基酸置换修饰将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法。通过两个途径实现：化学修饰法：由于可用试剂的限制，获得的种类少。蛋白质工程：利用基因操作技术。氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法，例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。定点突变（sitedirectedmutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（ProteinEngineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。(7)氨基酸置换修饰酶分子的定点突变基因序列分析→蛋白质结构分析→酶活性中心分析→

→

→→→引物设计进行基因定点突变→酶基因克隆表达→变异特性分析①通过蛋白质的保守序列或核苷酸序列，设计核苷酸引物或探针，从cDNA库或基因组文库中获取编码该蛋白质的基因序列，或进行PCR扩增和RT-PCR扩增以获得目的基因片段；②测定基因的核苷酸序列，获得该蛋白质的氨基酸序列；③对该蛋白质进行结构分析和（或）预测；④设计蛋白质的改造方案；⑤进行分子力学和分子动力学模拟；⑥对基因序列进行突变和改造；⑦将经过改造的基因片段插入合适的载体中克隆和表达；⑧分离纯化表达产物并对其进行结构和功能检测。酶分子修饰的基本要求和条件对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。（1）酶的稳定性热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。（2）酶活性中心的状况活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。酶分子修饰的条件修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。（1）pH与离子强度pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。（2）修饰反应的温度与时间

严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。（3）反应体系中酶与修饰剂的比例酶修饰后的性质变化热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km值变大。酶修饰剂天然酶最适pH修饰酶最适pH猪肝尿酸酶糜蛋白酶白蛋白PEG肝素10.58.28.07.4～8.599.0天然酶和修饰酶的最适pH7.1.2酶的人工模拟

⑴定义:所谓人工酶(artificialenzyme模拟酶，酶模型)是指根据酶作用的原理摸拟酶的活性中心和催化机理，用有机化学和生物学的方法合成具有专一催化功能的新型催化剂。⑵人工酶的理论基础人工酶的酶学基础

人工酶的设计：酶的作用机制人工体系的识别、结合和催化超分子化学“主-客体”化学：主体与客体通过配位键或其他次级键形成稳定复合物的化学领域称之。超分子的形成源于底物和受体的结合，这种结合基于非共价键相互作用。设计要点酶模型应为底物提供良好的微环境；催化基团必须相对于结合点尽可能同底物的功能团相接近，以促使反应定向发生；模型应具有足够的水溶性，并在接近生理条件下保持其催化活性。⑶模拟酶的分类按照模拟酶的属性，可分为半合成酶主-客体模拟酶胶束酶肽酶抗体酶分子印迹酶全合成酶

通过将催化基团并入有机化合物，控制空间构象，选择性地催化化学反应。全合成酶包括小分子有机物(大多为金属络合物)、胶束模拟酶、肽酶、抗体酶(催化抗体)、人工聚合物酶。半合成酶以天然蛋白质或酶为母体，用化学或生物学方法引进适当的活性部位或催化基团，或改变其结构从而形成一种新的人工酶。Kaiser小组黄素木瓜蛋白酶(FP)主-客体模拟酶利用各种有机分子(如β-环糊精、卟啉等)和具有催化功能的基团结合而制备的具有水解、氧化还原、转氨等功能的全合成酶。

全合成酶的模型分子：环糊精（cyclodextrin简称CD）

-环糊精分子结构

环糊精分子的空间填充模型胶束酶胶束在水溶液中提供了疏水微环境，类似于酶的结合部位，可以对底物束缚。将催化基团如咪唑、硫醇、羟基和辅酶共价或非共价连接或吸附于胶束上，可使其成为具有酶活力的胶束模拟酶。单分子胶束酶模型肽酶pepzyme模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。抗体酶概述

酶与抗体的差别：酶是能与反应过渡态选择结合的催化性物质，抗体是和基态分子结合的催化性物质。是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。

7.1.3抗体酶(abzyme)抗体酶催化的反应类型酰基转移反应重排反应氧化还原反应金属螯合反应磷酸酯水解反应

磷酸酯闭环反应光诱导反应

a.光聚合反应（二聚作用）

b.光裂解反应利用过渡态类似物制备抗体示意图制备方法诱导法引入法拷贝法研究展望研究酶作用机理，获得蛋白质结构与功能间关系的一般规律。获得一类新型的蛋白酶。催化天然酶不能催化的反应。抗体酶的催化反应制备方法酰基转移反应重排反应氧化还原反应金属螯和合反应磷酸酯水解反应磷酸酯闭环反应光诱导反应a.光聚合反应（二聚作用）b.光裂解反应诱导法引入法(修饰法)拷贝法7.1.4印迹酶分子印迹(molecularimprinting)技术概述分子印迹原理分子印迹技术的分类分子印迹聚合物的制备方法分子印迹酶生物印迹酶分子印迹技术：制备对某一化合物具有选择性的聚合物（MIP）的过程。这个化合物叫印迹分子P，也叫做模板分子T。具体过程：模板结合→聚合→去除P形成的聚合物内保留有与印迹分子的形状大小完全一样的孔穴分子印迹方法自组装法预组织法可逆共价结合法非共价相互作用金属螯合作用表面分子印迹无机物为载体的表面印迹固体材料的表面修饰蛋白质的表面印迹分子印迹酶通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，并可以在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列。性质：遵循米氏方程，催化活力依赖反应速度常数。印迹底物及其类似物酶的催化是从对底物的结合开始的，产生对底物的识别可促进催化。将催化基团定位在印迹空腔的合适位置对印迹酶发挥催化效率相当重要。通常引入催化剂团的方法为诱导法，即通过相反电荷等的相互作用引入互补基团。印迹过渡态类似物用过渡态类似物作印迹分子制备的印迹聚合物也能结合反应过渡态，降低反应活化能，从而加速反应。适当地设计印迹分子和具有催化基团的功能单体，将稳定过渡态和催化基团的准确定向结合起来是提高模拟酶活力的关键。生物印迹生物印迹：指以天然的生物材料，如蛋白质和糖类物质为骨架，在其上进行分子印迹而产生对印迹分子具有特异性识别空腔的过程。有机相生物印迹酶水相生物印迹酶非水相生物印迹酶制备示意图7.2生物酶工程酶的蛋白质结构功能新酶分子蓝图选择性修饰方案突变酶

新酶克隆酶产品效用发展酶基因遗传设计遗传修饰DNA重组技术DNA重组技术分子酶工程学Molecularenzymeengineering当前的研究热点可以概括为3个方面:一是利用基因工程技术大量生产酶制剂;二是通过基因定点突变和体外分子定向进化对天然酶蛋白进行改造;三是通过基因和基因片段的融合构建双功能融合酶。基因工程的操作步骤示意图7.2.1酶的基因克隆和异源表达酶基因克隆及表达的大致步骤如图示：

一个理想的宿主应具备以下几个特性：一个理想的宿主应具备的条件？酶的基因克隆和异源表达每一种新基因都有不同的表达难度。基因工程菌在培养过程中,常易出现质粒变异和缺失现象,从而严重影响重组酶的产率。其原因主要是产生了质粒的“分离不稳定性”和“结构不稳定性”。从生产角度而言,基因表达产物合成后,外泌显然更为有利。要使表达产物能够外泌,通常要在产物的Ｎ末端添加一段有10个左右亲水氨基酸和相继20～30个疏水氨基酸组成的信号肽。酶的基因克隆和异源表达解决重组酶蛋白在宿主细胞中的稳定性问题可从三方面着手:一是选择蛋白酶基因缺失的变异株作为受体细胞；二是同时克隆蛋白酶抑制基因;三是促进基因表达产物的加速分泌。7.2.2酶分子的定向改造和进化分子酶工程设计可以采用定点突变(Sitedirectedmutagenesis)和体外分子定向进化(Invitromoleculardirectedevolution)两种方式对天然酶分子进行改造。定点突变需要知道酶蛋白的一级结构及编码序列,并根据蛋白质空间结构知识来设计突变位点。酶分子的定向改造和进化－定点突变技术蛋白质工程体系示意图改造方法化学全合成法限制性内切核酸酶酶切片段取代法寡核苷酸引物指导的定点突变定点突变寡核苷酸定位诱变7.2.2酶的定向进化酶分子的合理设计(rationaldesign)酶分子的定向进化(directedevolution)加速进化

快速改变农业进化

自发突变

育种

筛选革命

极快改变实验室进化

加快突变速度

分子育种

筛选进化

逐步过程自然进化

自发突变

重组

自然选择酶分子定向进化简介基本原理对酶分子的改造，几十年来的工作都着眼于两个方面，一是基于序列的合理化设计方案(sequentialrationaldesign)，如化学修饰、定点突变(site-directedmutagenesis)等；二是利用基因的可操作性，模拟自然界的演化进程的非合理设计方案(irrationaldesign)，如定向进化(directedevolution)、杂合进化(hybridevolution)等。酶的合理设计体外定向进化的意义理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件。所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用TaqDNA聚合酶不具有3’->5’校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的定向进化的原理定向进化的策略易错PCR(Error-pronePCR)技术为代表的无性进化DNA改组（DNAshuffling）技术为代表的有性进化体外随机重组法(RPR)

交错延伸法(StEP)外显子改组（exonshuffling）又称有性PCR(sexualPCR)，原理。该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异，最终获取最佳突变组合的酶。通过DNA改组,不仅可加速积累有益突变，而且可使酶的2个或更多的已优化性质合为一体。类似于DNA改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，前者尤其适用于真核生物。在自然界中，不同分子的内含子间发生同源重组，导致不同外显子的结合，是产生新蛋白质的有效途径之一。与DNA改组不同，外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。DNAshufflingscreenandselect*

**

*

**

PCRDNaseI*

**

*

PCR*

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libraryDenature&anneal5’5’***Homo-duplexformation5’5’**5’5’**5’3’3’5’**fillin&lify**Error-pronePCRDNAShufflingDNAFamilyshufflingParentalSequencesRandomFragmentationDenaturizationAnnealingExtentionFinalLibrarycrossoverRepeatedCyclesofPrimerlessPCR

定向进化的基本过程SinglegeneDNAshufflingMultiplegenesDNAfamilyshufflingExpressionandscreenRepeatedasneededStaggeredExtensionProcess(StEP)DenaturationAnnealing,

ExtensionDNADNADenaturationAnnealing,

Extension

error-pronePCR2-6nucleotidemutations/DNAmolecule1-3aminoacidsubstitutions/proteinmoleculeDNAshufflinghighhomologyatDNAlevel(>60%identity)

-fragmentationbyDNase(multiplerecombination) -restrictionenzymes(multiplerecombination)lowhomologyatDNAlevel

-domainswapping(single-siterecombination;ITCHY) -shufflingof“syntheticgenes”(multiplerecombination)实验室进化-进化方法比较

定向进化的选择策略1、定向进化中，突变具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类，降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。2、通常,筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关。另有一些其他的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。高通量的筛选体系高通量筛选－－无理设计的有理部分selection选择screening筛选有理设计与定向进化的有机结合将是解决复杂酶设计问题的有效途径选择起始基因重组表达，建立测活体系和/或筛选方法如果知道结构功能关系，第一步先采用有理设计方法此后，以随机突变技术微调得到的突变体,并辅以高效的体内或体外筛选

小结蛋白质工程实验策略生物催化工艺开发Developmentofbiocatalyticalprocesses

克隆

cloning改造engineering发酵fermentation生物转化

biotransformation表达expression纯化purification定向进化的应用BiocatalystsProteinDrugEvolvedVectorVaccineGeneTherapySmallMoleculePharmaceuticalsAntibodyStrainEvolution定向进化的应用提高酶分子的催化活力提高酶分子的稳定性提高底物的专一性改善酶的其他性能酶性质突变方法枯草杆菌蛋白酶E有机相活性/稳定性易错PCRβ-内酰胺酶总活力/底物专一性DNA改组枯草杆菌蛋白酶BPN′稳定性盒式诱变对硝基苯酯酶底物专一性/有机相活性易错PCR/DNA改组胸腺嘧啶核苷激酶底物专一性盒式诱变β-半乳糖苷酶底物专一性DNA改组绿色荧光蛋白荧光DNA改组核酶底物专一性易错PCR/DNA改组天冬氨酸酶活性与稳定性随机/定位诱变药物和疫苗活性/专一性/最佳表达DNA改组酶的体外定向进化应用实例DNAshuffling–β-lactamasecaseβ-Lactamase:hydrolysisofbeta-lactamantibioticsβ-lactamaseAmpicillinCefotaxi