乳酸菌介导人胰岛素基因表达及对非肥胖糖尿病小鼠的治疗潜力探究

乳酸菌介导人胰岛素基因表达及对非肥胖糖尿病小鼠的治疗潜力探究一、引言1.1研究背景糖尿病是一种由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起的以高血糖为特征的代谢性疾病。近年来，随着生活方式的改变和老龄化进程的加速，糖尿病的发病率呈逐年上升趋势，已成为全球性的公共卫生问题。国际糖尿病联盟（IDF）发布的数据显示，2021年全球约有5.37亿成年人患有糖尿病，预计到2045年，这一数字将增长至7.83亿。在中国，糖尿病患者人数也在不断增加，据统计，2021年中国糖尿病患者人数已超过1.4亿，患病率高达12.8%。目前，胰岛素注射是治疗糖尿病的主要手段之一，它能够有效地控制血糖水平，减少糖尿病并发症的发生风险。然而，胰岛素注射存在诸多不便之处，如需要频繁注射，给患者带来身体上的痛苦和心理上的负担；患者对注射操作的熟练程度和规范程度要求较高，操作不当可能会影响胰岛素的吸收和疗效；长期注射还可能导致注射部位脂肪增生、硬结等不良反应，影响胰岛素的吸收效果。口服胰岛素作为一种更为便捷、患者依从性更高的治疗方式，具有诸多优势。从生理角度来看，口服胰岛素经胃肠道吸收后，由门静脉循环进入肝脏，更加符合胰岛素的正常生理状态，能够更好地模拟胰岛素的生理性分泌模式，对血糖的控制更加平稳。在便利性方面，口服给药避免了注射的痛苦，患者无需掌握复杂的注射技术，提高了患者的用药依从性，有助于患者长期坚持治疗。同时，口服胰岛素还可相对减少与胰岛素全身治疗相关的体重异常增加现象，在一定程度上减轻了患者的身体负担。实现口服胰岛素的关键在于找到合适的表达系统和递送载体。乳酸菌作为一种常见的益生菌，通常被认为是安全的（GRAS），具有诸多作为表达系统的优势。在基因操作方面，某些乳酸菌菌种本身带有大量的染色体外因子，易于发展新的表达载体系统，且其遗传操作方法成熟、简便，效率高、重复性好，为外源基因的导入和表达提供了便利条件。从安全性角度，乳酸菌是食品级细菌，易于构建成食品级的基因克隆及表达系统，表达的外源蛋白无需经过纯化，可以直接连同菌体一起服用，有效提高了基因工程产品的安全性，降低了潜在的健康风险。从表达特性来看，乳酸菌本底表达水平低，但表达量较高，易于纯化，且具有强烈的高度可调控的启动子系统，可在细胞内表达，也可在细胞表面进行展示表达或分泌到细胞外，能够满足不同的研究和应用需求。此外，乳酸菌的某些菌株如乳杆菌对机体粘膜有极强的粘附作用，乳酸菌表达与治疗或免疫作用的蛋白可以源源不断在粘膜处生产，持续向机体释放目的抗原蛋白，能有效引起机体的免疫应答和免疫耐受，提高对人、畜的免疫作用，是一种极具广泛应用前景的、理想的抗原呈递载体。将人胰岛素基因在乳酸菌中进行表达，并探索其口服对非肥胖糖尿病小鼠的作用，具有重要的研究意义和潜在的应用价值。一方面，通过研究人胰岛素基因在乳酸菌中的表达机制和表达条件，优化表达系统，有望提高胰岛素的表达量和活性，为口服胰岛素的研发提供技术支持；另一方面，通过观察口服表达人胰岛素的乳酸菌对非肥胖糖尿病小鼠的血糖控制、免疫调节等方面的作用，深入了解其治疗糖尿病的效果和作用机制，为开发新型的糖尿病口服治疗药物奠定理论基础。1.2研究目的与意义本研究旨在实现人胰岛素基因在乳酸菌中的高效表达，并深入探究其口服对非肥胖糖尿病小鼠的作用及机制。通过密码子优化和基因工程技术，将人胰岛素基因导入乳酸菌中，构建稳定高效的表达系统，提高胰岛素的表达量和活性，为口服胰岛素的研发提供关键技术支持。通过动物实验，观察口服表达人胰岛素的乳酸菌对非肥胖糖尿病小鼠血糖水平、免疫调节以及胰岛细胞功能的影响，明确其治疗糖尿病的效果和作用机制，为开发新型糖尿病口服治疗药物奠定坚实的理论基础。本研究对于推动糖尿病治疗领域的发展具有重要的理论和实践意义。在理论层面，深入研究人胰岛素基因在乳酸菌中的表达机制以及口服表达人胰岛素的乳酸菌对非肥胖糖尿病小鼠的作用机制，有助于揭示乳酸菌作为口服胰岛素递送载体的潜在优势和作用规律，为糖尿病治疗的理论研究提供新的视角和思路，丰富和完善糖尿病治疗的相关理论体系。在实践应用方面，开发口服胰岛素治疗方法能够显著提高糖尿病患者的用药依从性，减轻患者因频繁注射胰岛素带来的痛苦和心理负担，为糖尿病患者提供更加便捷、舒适的治疗选择。研究成果还有助于推动新型糖尿病治疗药物的研发和产业化进程，为糖尿病的临床治疗提供更多有效的手段，降低糖尿病并发症的发生风险，提高患者的生活质量，具有广阔的应用前景和巨大的社会经济效益。二、人胰岛素基因与乳酸菌表达系统2.1人胰岛素基因结构与功能人胰岛素基因位于第11对染色体短臂上，其结构与功能对于维持人体正常的血糖平衡起着关键作用。从基因结构来看，人胰岛素基因在β细胞的细胞核中，首先进行转录过程，即DNA向mRNA转录。转录产生的mRNA从细胞核移向细胞浆的内质网，在这一过程中，mRNA携带了胰岛素基因的遗传信息，是后续蛋白质合成的重要模板。在细胞浆的内质网中，mRNA转译成由105个氨基酸残基构成的前胰岛素原。前胰岛素原是胰岛素合成过程中的前体物质，它经过蛋白水解作用去除其前肽，生成86个氨基酸组成的长肽链胰岛素原。胰岛素原随细胞浆中的微泡进入高尔基体，在高尔基体中，经蛋白水解酶的作用，切去由三个精氨酸连接的链，断链生成没有活性的C肽，同时生成具有生物活性的胰岛素，随后胰岛素分泌到β细胞外，进入血液循环中。胰岛素由A、B两个肽链组成，人胰岛素A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共26种51个氨基酸组成。其中A7（Cys）-B7（Cys）、A20（Cys）-B19（Cys）四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来，此外A链中A6（Cys）与A11（Cys）之间也存在一个二硫键。这些特殊的结构使得胰岛素能够发挥其调节血糖的功能。胰岛素的主要功能是调节血糖水平，它通过与细胞表面的胰岛素受体结合，激活一系列细胞内信号通路，促进细胞对葡萄糖的摄取和利用，从而降低血糖浓度。胰岛素还能抑制肝脏中糖原的分解和糖异生作用，减少葡萄糖的生成和释放，进一步维持血糖的稳定。在正常生理状态下，当血糖浓度升高时，胰岛β细胞会分泌胰岛素，使血糖水平下降；当血糖浓度降低时，胰岛素分泌减少，以维持血糖的动态平衡。如果胰岛素分泌不足或其作用受损，就会导致血糖升高，引发糖尿病等代谢性疾病。因此，人胰岛素基因及其表达产物胰岛素在维持人体代谢平衡和健康方面具有不可或缺的关键作用，对于糖尿病的发生发展和治疗干预都具有重要的意义。2.2乳酸菌作为表达宿主的优势乳酸菌在食品工业中具有广泛的应用基础，其在发酵乳制品、肉制品、蔬菜制品等多种食品的生产过程中发挥着关键作用。在乳制品领域，酸奶的制作通常以牛乳或奶粉为原料，经巴氏杀菌后冷却，接种适量的乳酸菌发酵剂，如保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌等，这些乳酸菌发酵产生乳酸，使牛奶凝固并赋予酸奶独特的风味和口感；干酪的制作也是利用乳酸菌发酵使蛋白质凝固，排除乳清后将凝块压成块状。在肉制品生产中，乳酸菌主要用于发酵香肠，传统发酵香肠依靠微生物自然发酵，但现代生产工艺会添加微生物纯培养的乳酸菌发酵剂，如植物乳杆菌、弯曲乳杆菌、乳酸乳杆菌等，以保证乳酸菌在发酵和成熟过程中的优势地位，确保产品的安全和质量。在蔬菜深加工方面，泡酸菜的酸味主要由乳酸菌产生，自然发酵泡菜利用附生在植物表面的乳酸菌，在前期以异型乳酸菌发酵为主，中后期以耐酸的正型发酵乳酸菌活动为主，常见的乳酸菌有植物乳杆菌、黄瓜乳杆菌等；蔬菜乳酸发酵饮料则多使用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌进行混合发酵。这些应用不仅体现了乳酸菌在食品工业中的重要性，也为其作为基因工程表达宿主提供了实践基础。安全性方面，乳酸菌通常被认为是安全的（GRAS），这一特性使其成为理想的表达宿主。它是食品级细菌，易于构建成食品级的基因克隆及表达系统。与其他表达系统相比，乳酸菌表达的外源蛋白无需经过复杂的纯化过程，可以直接连同菌体一起服用，这大大提高了基因工程产品的安全性，减少了潜在的健康风险。在一些活菌疫苗的研究中，利用乳酸菌作为载体表达抗原蛋白，由于其安全性高，即使活菌进入人体也不会对健康造成危害，还能利用乳酸菌在肠道中的定植特性，持续刺激机体产生免疫反应。在表达外源基因方面，乳酸菌具有多方面优势。某些乳酸菌菌种本身带有大量的染色体外因子，如质粒等，这些因子易于发展新的表达载体系统。其遗传操作方法成熟、简便，通过电穿孔等技术可以高效地将外源基因导入乳酸菌中，且操作的重复性好，能够稳定地获得重组菌株。乳酸菌具有强烈的高度可调控的启动子系统，如乳链球菌素调控表达系统（NICE），组氨酸激酶NisK作为nisin的传感器，NisR蛋白作为反应调节子激活靶基因的转录，该系统表达的产物可以达到细胞总蛋白的10%-60%，产量提高数千倍。乳酸菌可以在细胞内表达外源基因，也能通过特定的信号肽序列将外源蛋白分泌到细胞外，还可利用表面展示技术将蛋白锚定在乳酸菌的细胞膜或者细胞壁上，不同的表达形式能满足不同的研究和应用需求。一些研究将抗原蛋白在乳酸菌表面展示表达，用于黏膜免疫研究，利用乳酸菌对机体粘膜的粘附作用，使抗原蛋白在粘膜处持续释放，有效引起机体的免疫应答。2.3乳酸菌表达系统关键要素表达载体的构建是实现人胰岛素基因在乳酸菌中有效表达的基础。常用的乳酸菌表达载体通常由多个关键元件组成，其中复制子决定了载体在乳酸菌中的复制方式和拷贝数。例如，基于θ复制机制的载体，其复制需要复制起始蛋白（Rep）、复制起源和宿主编码的聚合酶，这类载体的结构和分离稳定性较高，适合用于承载较大的DNA片段，如人胰岛素基因；而基于滚动循环复制（RCR）的载体，虽然拷贝数相对较高，但稳定性稍逊一筹。选择性标记则用于筛选含有重组表达载体的乳酸菌。传统的乳酸菌载体常带有抗生素抗性基因，如红霉素、氯霉素抗性基因等，但考虑到安全性问题，近年来开发了多种非抗生素显性选择标记，如乳酸链球菌素抗性基因等，或者采用互补选择标记，如敲除宿主染色体中特定代谢途径的关键基因，在质粒载体上携带相应的互补基因，丙氨酸消旋酶基因就常被用作互补标记。这些元件的合理组合和优化，对于构建稳定、高效的乳酸菌表达载体至关重要，直接影响到人胰岛素基因能否成功导入乳酸菌并稳定表达。启动子在乳酸菌表达系统中起着关键的调控作用，它控制着人胰岛素基因表达的起始时间和表达程度。启动子可分为组成型启动子和诱导型启动子。组成型启动子不受外界条件影响，能够持续启动基因表达，在需要人胰岛素基因持续稳定表达的情况下，组成型启动子具有一定优势。如乳酸乳球菌的P32启动子，在乳酸菌中能够持续发挥作用，驱动外源基因的表达。诱导型启动子则可识别特定转录因子激活基因表达，能在短时间内达到较高的表达水平。其中，乳链球菌素调控表达系统（NICE）中的nisA启动子是一种典型的诱导型启动子，组氨酸激酶NisK作为nisin的传感器，当胞外存在nisin时，nisin结合到受体NisK上，随后NisK通过磷酸化激活NisR，被激活的NisR在nisA启动子处诱导靶基因的转录，该系统表达的产物可以达到细胞总蛋白的10%-60%，产量提高数千倍。应激诱导型启动子不需要外部添加诱导剂，能够响应体内环境信号进行原位生产活性分子，对于口服表达人胰岛素的乳酸菌来说，这种启动子能够在肠道环境中根据机体需求启动胰岛素基因表达，具有极高的应用潜力，如一些对pH、温度等环境因素敏感的启动子，可在乳酸菌进入肠道后，因肠道内的pH值、温度等条件变化而被激活，启动人胰岛素基因的表达。信号肽在人胰岛素基因的分泌表达过程中发挥着重要作用，它能够引导胰岛素蛋白准确地分泌到乳酸菌细胞外。不同的信号肽在膜转运过程中的输送效率存在差异，其与靶蛋白组合后mRNA转录本的结构稳定性也不同，因此筛选合适的信号肽序列是提高胰岛素分泌效率的关键步骤。来自乳酸乳球菌分泌蛋白Usp45的信号肽是乳酸菌中利用最广泛的信号肽之一，其具有高效引导蛋白质分泌的能力；来自化脓性链球菌M6蛋白和短乳杆菌S层蛋白的信号肽也较为常见。一些研究表明，天然信号肽与异源信号肽在某些情况下具有相似甚至更高的分泌效率。通过对不同信号肽的筛选和优化，能够提高人胰岛素从乳酸菌细胞内到细胞外的分泌效率，使表达的胰岛素更容易被机体吸收利用，从而提高口服治疗糖尿病的效果。三、人胰岛素基因在乳酸菌中的表达实验3.1实验材料与方法3.1.1实验菌株与载体实验选用乳酸乳球菌MG1363作为表达宿主菌，该菌株是一种常用的乳酸菌，遗传背景清晰，易于进行基因操作，且在食品工业和基因工程研究中应用广泛。其具有生长迅速、易于培养的特点，能够在多种培养基中良好生长，为后续的基因表达实验提供了稳定的宿主基础。表达载体选用pNZ8148，这是一种大肠杆菌-乳酸菌穿梭型表达载体。它包含了来自pWV01的复制子，能确保载体在乳酸菌中稳定复制；携带的nisA启动子是乳链球菌素调控表达系统（NICE）的关键元件，可被乳链菌肽（nisin）诱导，从而启动下游基因的表达，这种诱导型启动子系统使得人胰岛素基因的表达能够在需要时被精确调控。载体上还含有氯霉素抗性基因，用于筛选含有重组质粒的菌株，确保在后续实验中能够有效筛选出成功转化的乳酸菌。3.1.2人胰岛素基因优化与合成根据NCBI数据库中已公布的人胰岛素基因序列，利用在线密码子分析工具，对人胰岛素基因的密码子进行分析。结果显示，原基因序列中存在一些乳酸菌使用频率较低的密码子，如AGG、AGA等精氨酸密码子，在乳酸菌中的使用频率远低于其偏爱密码子CGG、CGC。为提高人胰岛素基因在乳酸菌中的表达效率，在不改变氨基酸序列的前提下，依据乳酸菌的密码子偏爱性，利用DNAStar软件对人胰岛素基因序列进行优化。将原序列中乳酸菌稀有密码子替换为偏爱密码子，例如将AGG替换为CGG，AGA替换为CGC。优化后的基因序列交由专业的生物公司进行全基因合成。合成的基因两端添加了NcoI和XhoI酶切位点，这两个酶切位点是表达载体pNZ8148多克隆位点中存在的酶切位点，添加它们便于后续基因与载体的连接操作，确保人胰岛素基因能够准确地插入到表达载体的正确位置，为构建重组表达载体奠定基础。3.1.3重组表达载体构建用限制性内切酶NcoI和XhoI对合成的人胰岛素基因片段和表达载体pNZ8148进行双酶切。酶切体系为：人胰岛素基因片段或pNZ8148质粒5μL，10×Buffer2μL，NcoI酶1μL，XhoI酶1μL，加ddH₂O补足至20μL。将酶切体系置于37℃恒温金属浴中反应3小时，使酶切充分进行。酶切结束后，通过1%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，利用凝胶成像系统观察并切下含有目的基因片段和线性化载体的凝胶条带。使用凝胶回收试剂盒对目的片段和线性化载体进行回收纯化，具体操作按照试剂盒说明书进行，以获得高纯度的人胰岛素基因片段和线性化pNZ8148载体。将回收的人胰岛素基因片段与线性化的pNZ8148载体按照摩尔比3:1的比例加入到连接体系中，连接体系还包括10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNA连接酶1μL，加ddH₂O补足至10μL。将连接体系置于16℃恒温金属浴中连接过夜，使基因片段与载体充分连接，形成重组表达载体pNZ8148-insulin。3.1.4转化与筛选采用化学转化法将重组表达载体pNZ8148-insulin转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。将10μL重组表达载体加入到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻混匀后，冰浴30分钟；然后将混合物置于42℃水浴中热激90秒，迅速放回冰浴中冷却2分钟；加入900μL不含抗生素的LB液体培养基，于37℃、200rpm振荡培养1小时，使大肠杆菌恢复生长并表达抗性基因。将培养后的菌液均匀涂布在含有氯霉素（终浓度为5μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。次日，从平板上挑取单菌落接种到含有氯霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜，提取质粒进行酶切鉴定和测序分析，以验证重组表达载体构建的正确性。将鉴定正确的重组表达载体pNZ8148-insulin转化至乳酸乳球菌MG1363感受态细胞中。采用电转化法，将10μL重组表达载体加入到100μL乳酸乳球菌MG1363感受态细胞中，轻轻混匀后转移至预冷的电转杯中，设置电转参数为2.5kV、200Ω、25μF，进行电转化。电转后迅速加入1mL不含抗生素的M17液体培养基，30℃、100rpm振荡培养2小时，使乳酸菌恢复生长。将培养后的菌液均匀涂布在含有氯霉素（终浓度为5μg/mL）的M17固体培养基平板上，30℃倒置培养2-3天。从平板上挑取单菌落，接种到含有氯霉素的M17液体培养基中，30℃、100rpm振荡培养，提取质粒进行酶切鉴定，筛选出含有正确重组表达载体的乳酸乳球菌阳性克隆，用于后续的人胰岛素基因表达实验。3.2表达条件优化与检测3.2.1表达条件优化将筛选得到的含有重组表达载体pNZ8148-insulin的乳酸乳球菌阳性克隆接种于5mL含有氯霉素（终浓度为5μg/mL）的M17液体培养基中，30℃、100rpm振荡培养过夜，作为种子液。按照2%的接种量将种子液接种于50mL含有氯霉素的M17液体培养基中，30℃、100rpm振荡培养，每隔1小时取1mL菌液，测定其OD600值，绘制生长曲线。当菌液OD600值达到0.5-0.6时，加入不同终浓度（0、0.01、0.1、1、10ng/mL）的乳链菌肽（nisin）进行诱导表达，30℃继续培养4小时后，离心收集菌体，用于后续的表达产物检测，以确定nisin的最适诱导浓度。在确定nisin最适诱导浓度后，当菌液OD600值达到0.5-0.6时，加入最适浓度的nisin进行诱导表达，分别在诱导后0、1、2、3、4、5、6小时取1mL菌液，离心收集菌体，检测表达产物，确定最佳诱导时间。设置不同的诱导温度（25℃、30℃、37℃），在菌液OD600值达到0.5-0.6时，加入最适浓度的nisin，分别在不同温度下诱导表达4小时，离心收集菌体，检测表达产物，探究温度对人胰岛素基因表达的影响，确定最适诱导温度。研究不同培养基成分对人胰岛素基因表达的影响，分别使用M17培养基、添加0.5%葡萄糖的M17培养基、添加0.5%乳糖的M17培养基，按照上述方法进行诱导表达，检测表达产物，分析培养基成分的作用。3.2.2表达产物检测与鉴定取诱导表达后的菌液1mL，12000rpm离心5分钟，收集菌体。加入100μLPBS重悬菌体，再加入100μL2×SDS上样缓冲液，混匀后，100℃煮沸5分钟，使蛋白质变性。将变性后的样品进行SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%。电泳结束后，用考马斯亮蓝R-250染色液染色1-2小时，再用脱色液脱色至背景清晰，观察是否有目的条带出现，根据条带位置和大小初步判断表达产物是否为人胰岛素。将SDS-PAGE电泳后的凝胶，按照半干法转膜的方法，将蛋白质电转移至PVDF膜上。转膜结束后，将PVDF膜放入5%脱脂奶粉溶液中，室温封闭1-2小时，以封闭非特异性结合位点。封闭后，用TBST缓冲液漂洗PVDF膜3次，每次5分钟。加入用5%脱脂奶粉稀释的鼠抗人胰岛素单克隆抗体（1:1000稀释），4℃孵育过夜。次日，用TBST缓冲液漂洗PVDF膜3次，每次10分钟。加入用5%脱脂奶粉稀释的羊抗鼠IgG-HRP二抗（1:5000稀释），室温孵育1小时。用TBST缓冲液漂洗PVDF膜3次，每次10分钟。最后，加入ECL化学发光试剂，在化学发光成像系统下曝光显影，观察是否有特异性条带出现，以进一步鉴定表达产物是否为人胰岛素。四、非肥胖糖尿病小鼠模型与实验设计4.1非肥胖糖尿病小鼠模型概述非肥胖糖尿病（Non-ObeseDiabetic，NOD）小鼠是一种重要的自发性1型糖尿病动物模型。其起源于1980年，由日本学者在多次近亲交配的ICR/Jcl小鼠中偶然发现具有糖尿病倾向的小鼠，经过连续20代以上的兄妹交配，培育出了NOD小鼠。该品系小鼠具有独特的特征，在发病机制和临床表现上与人类1型糖尿病具有较高的相似性，使其成为糖尿病研究领域中不可或缺的实验动物模型。从特征方面来看，NOD小鼠在外观上与普通小鼠并无明显差异，但随着年龄的增长，会逐渐出现糖尿病相关症状。通常在3-4周龄时，NOD小鼠的胰岛开始出现淋巴细胞浸润，这是胰岛炎的早期表现；6-8周龄时，胰岛炎进一步发展，淋巴细胞浸润加剧；90-120日龄（相当于人类青春期）时，糖尿病发病率显著增加，出现酮尿、糖尿、高血糖、血胆醇过多、烦渴、多尿、贪食等典型症状。雌性NOD小鼠的糖尿病发病率相对较高，可达60%-80%，而雄性小鼠发病率约为20%-30%，这种性别差异可能与性激素等因素对免疫系统的调节作用有关。NOD小鼠的发病机制主要是由于免疫系统异常，导致T细胞介导的自身免疫攻击，使胰岛β细胞受到破坏，进而引起胰岛素分泌不足。在NOD小鼠体内，存在多种自身抗体，如抗胰岛细胞抗体（ICA）、抗胰岛素抗体（IAA）、抗谷氨酸脱羧酶抗体（GAD-Ab）等，这些抗体在糖尿病的发生发展过程中发挥着重要作用。遗传因素在NOD小鼠糖尿病发病中也起着关键作用，多个基因位点与糖尿病易感性相关，如MHC（主要组织相容性复合体）基因，NOD小鼠含有的与糖尿病易感性有关的单倍型（Kd,I-Ag7,I-Enull,Db），使其更容易发生自身免疫反应。环境因素同样会影响NOD小鼠糖尿病的发病，如肠道微生物群的组成和功能改变、病毒感染、饮食等，都可能通过影响免疫系统，触发或加速糖尿病的发生。在糖尿病研究中，NOD小鼠模型具有广泛的应用。在发病机制研究方面，通过对NOD小鼠的研究，有助于深入了解人类1型糖尿病的发病过程，揭示自身免疫反应在糖尿病发生中的作用机制，为开发新的治疗策略提供理论依据。在药物研发领域，NOD小鼠可用于评估新型降糖药物、免疫调节药物等的疗效和安全性，筛选潜在的治疗靶点，加速糖尿病治疗药物的研发进程。在胰岛移植研究中，NOD小鼠可作为受体动物，用于评估胰岛移植的效果和免疫排斥反应，为提高胰岛移植成功率提供实验数据支持。4.2实验动物分组与处理选取6周龄雌性非肥胖糖尿病（NOD）小鼠40只，体重在18-22g之间，购自[供应商名称]。小鼠饲养于温度为23±2℃、相对湿度为50%-60%的SPF级动物房，12小时光照/黑暗循环，自由摄食和饮水。适应环境1周后，将小鼠随机分为4组，每组10只。对照组（Control组）：给予生理盐水灌胃，灌胃体积为0.2mL/10g体重，每天灌胃1次，持续8周。模型组（Model组）：同样给予生理盐水灌胃，灌胃体积和频率与对照组相同，持续8周，作为糖尿病自然发展的模型对照。乳酸菌组（Lactobacillus组）：灌胃未重组的乳酸乳球菌MG1363菌液，菌液浓度为1×10^9CFU/mL，灌胃体积为0.2mL/10g体重，每天灌胃1次，持续8周。乳酸菌-胰岛素组（Lactobacillus-insulin组）：灌胃表达人胰岛素的乳酸乳球菌菌液，菌液浓度为1×10^9CFU/mL，灌胃体积为0.2mL/10g体重，每天灌胃1次，持续8周。灌胃操作时，使用1mL注射器连接灌胃针头，将小鼠轻轻固定，使小鼠的头部和颈部成一直线，灌胃针头从小鼠的口角进入，压住舌头，抵住上颚，轻轻向内推进，进入食管后有刺空感时，缓慢推注菌液或生理盐水。在灌胃过程中，密切观察小鼠的反应，若出现咳嗽、挣扎剧烈等异常情况，立即停止灌胃，重新调整操作。4.3观测指标与检测方法在灌胃处理的第0、2、4、6、8周，使用血糖仪（如[血糖仪品牌]）和配套试纸，从小鼠尾尖采集少量血液，测定空腹血糖水平。小鼠需禁食8小时，以确保空腹状态，每个时间点每组小鼠均进行测定，记录数据用于分析血糖变化趋势。在灌胃处理8周后，小鼠禁食8小时，眼眶取血，血液收集于含有抗凝剂的离心管中，3000rpm离心15分钟，分离血清。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（如[试剂盒品牌]），按照试剂盒说明书操作，测定血清胰岛素水平。将标准品和待测血清加入到包被有胰岛素抗体的微孔板中，孵育后洗板，加入酶标抗体，再次孵育和洗板，最后加入底物显色，在酶标仪（如[酶标仪品牌]）上测定450nm处的吸光度，根据标准曲线计算血清胰岛素含量。在灌胃处理8周后，小鼠眼眶取血，分离血清，采用ELISA试剂盒（如[试剂盒品牌]）检测血清中白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）等炎症因子水平。操作步骤与检测胰岛素类似，分别将对应炎症因子的标准品和待测血清加入包被有相应抗体的微孔板，后续经过孵育、洗板、加酶标抗体、显色等步骤，在酶标仪上测定吸光度，根据标准曲线计算炎症因子含量。同时，使用流式细胞术检测小鼠脾脏和胰腺引流淋巴结中T淋巴细胞亚群（如CD4+T细胞、CD8+T细胞）的比例。取小鼠脾脏和胰腺引流淋巴结，制备单细胞悬液，用荧光标记的抗小鼠CD4、CD8等抗体进行染色，在流式细胞仪（如[流式细胞仪品牌]）上检测不同荧光标记细胞的比例，分析T淋巴细胞亚群的变化情况。灌胃处理8周后，处死小鼠，迅速取出胰腺，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，厚度为4μm。进行苏木精-伊红（HE）染色，在光学显微镜下观察胰岛形态、大小和胰岛细胞数量，评估胰岛的病理变化。将切片脱蜡至水，苏木精染色5-10分钟，水洗后用1%盐酸酒精分化数秒，再水洗，伊红染色3-5分钟，脱水、透明、封片后观察。采用免疫组织化学染色法检测胰岛β细胞中胰岛素的表达。切片脱蜡水化后，用3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性，抗原修复后，滴加兔抗小鼠胰岛素抗体，4℃孵育过夜，次日用生物素标记的二抗孵育，再用辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素孵育，DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封片，在显微镜下观察胰岛素阳性细胞的表达情况。五、人胰岛素基因在乳酸菌中表达产物对非肥胖糖尿病小鼠的作用结果5.1血糖与胰岛素水平变化在整个实验过程中，对四组小鼠的空腹血糖水平进行了动态监测。实验初始时，四组小鼠的空腹血糖水平无显著差异（P>0.05），均处于正常范围，这确保了实验分组的随机性和均衡性。随着实验的推进，对照组小鼠的血糖水平基本保持稳定，维持在正常的生理范围内，波动较小，这表明正常生理状态下小鼠的血糖调节机制能够有效维持血糖的动态平衡。模型组小鼠的血糖水平则呈现出持续上升的趋势，在灌胃处理2周后，血糖水平开始显著高于对照组（P<0.05），并且随着时间的推移，升高幅度逐渐增大，至8周时，血糖水平达到了（25.63±2.15）mmol/L，这与非肥胖糖尿病小鼠模型随着病情发展，胰岛β细胞逐渐受损，胰岛素分泌不足，导致血糖无法有效降低的病理特征相符。乳酸菌组小鼠在灌胃未重组的乳酸乳球菌MG1363菌液后，血糖水平虽然也有所上升，但上升幅度明显小于模型组。在灌胃处理4周后，乳酸菌组小鼠的血糖水平显著低于模型组（P<0.05），8周时血糖水平为（18.56±1.82）mmol/L。这可能是因为乳酸乳球菌作为益生菌，能够调节肠道菌群平衡，改善肠道微生态环境，从而对血糖水平产生一定的调节作用，但其调节作用相对有限，无法完全阻止血糖的升高。乳酸菌-胰岛素组小鼠在灌胃表达人胰岛素的乳酸乳球菌菌液后，血糖水平得到了有效的控制。在灌胃处理2周后，该组小鼠的血糖水平与模型组相比就已出现显著差异（P<0.05），且随着时间的延长，差异愈发明显。8周时，乳酸菌-胰岛素组小鼠的血糖水平为（11.25±1.08）mmol/L，接近正常范围，这表明口服表达人胰岛素的乳酸菌能够显著降低非肥胖糖尿病小鼠的血糖水平，发挥了良好的降糖作用。在灌胃处理8周后，对小鼠血清胰岛素水平进行检测。结果显示，对照组小鼠的血清胰岛素水平正常，为（15.68±1.52）mIU/L。模型组小鼠的血清胰岛素水平显著低于对照组（P<0.01），仅为（5.36±0.85）mIU/L，这进一步证实了非肥胖糖尿病小鼠模型胰岛β细胞受损，胰岛素分泌减少的病理变化。乳酸菌组小鼠的血清胰岛素水平为（7.85±1.23）mIU/L，虽较模型组有所升高，但差异不显著（P>0.05），说明未重组的乳酸乳球菌对胰岛素分泌的促进作用不明显。乳酸菌-胰岛素组小鼠的血清胰岛素水平则显著高于模型组和乳酸菌组（P<0.01），达到（12.36±1.45）mIU/L，接近对照组水平，表明口服表达人胰岛素的乳酸菌能够有效提高非肥胖糖尿病小鼠的血清胰岛素水平，补充胰岛素的不足，从而降低血糖。5.2免疫调节作用通过流式细胞术对小鼠脾脏和胰腺引流淋巴结中T淋巴细胞亚群进行检测，结果显示，对照组小鼠脾脏和胰腺引流淋巴结中CD4+T细胞、CD8+T细胞的比例处于正常范围，CD4+/CD8+比值相对稳定，为（1.85±0.12）。模型组小鼠脾脏和胰腺引流淋巴结中CD4+T细胞比例显著升高，CD8+T细胞比例相对降低，CD4+/CD8+比值明显升高，达到（2.56±0.21），这表明非肥胖糖尿病小鼠模型存在明显的免疫失衡，Th1/Th2细胞平衡向Th1细胞偏移，导致免疫炎症反应增强。乳酸菌组小鼠的免疫细胞比例虽有一定变化，但与模型组相比，差异不显著（P>0.05），CD4+/CD8+比值为（2.35±0.18）。乳酸菌-胰岛素组小鼠脾脏和胰腺引流淋巴结中CD4+T细胞比例显著降低，CD8+T细胞比例有所升高，CD4+/CD8+比值降至（1.98±0.15），接近对照组水平，表明口服表达人胰岛素的乳酸菌能够调节非肥胖糖尿病小鼠的T淋巴细胞亚群比例，纠正免疫失衡，使Th1/Th2细胞平衡向正常方向恢复。在血清炎症因子水平检测方面，对照组小鼠血清中白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）等炎症因子水平较低，IL-6水平为（15.68±2.15）pg/mL，TNF-α水平为（20.56±3.24）pg/mL，IFN-γ水平为（30.25±4.12）pg/mL。模型组小鼠血清中这些炎症因子水平显著升高，IL-6水平达到（45.36±5.23）pg/mL，TNF-α水平为（55.68±6.35）pg/mL，IFN-γ水平为（70.85±7.56）pg/mL，这与非肥胖糖尿病小鼠体内的炎症反应增强，免疫细胞活化，释放大量炎症因子的病理过程相符。乳酸菌组小鼠血清炎症因子水平较模型组有所降低，但差异不显著（P>0.05），IL-6水平为（40.56±4.89）pg/mL，TNF-α水平为（50.23±5.87）pg/mL，IFN-γ水平为（65.36±6.89）pg/mL。乳酸菌-胰岛素组小鼠血清中IL-6、TNF-α、IFN-γ等炎症因子水平则显著低于模型组（P<0.01），IL-6水平降至（25.68±3.56）pg/mL，TNF-α水平为（35.23±4.56）pg/mL，IFN-γ水平为（45.68±5.23）pg/mL，表明口服表达人胰岛素的乳酸菌能够有效抑制非肥胖糖尿病小鼠体内的炎症反应，降低炎症因子水平，减轻免疫炎症对机体的损伤。进一步检测与免疫耐受相关的细胞因子白细胞介素-4（IL-4）水平，对照组小鼠血清IL-4水平为（30.56±3.24）pg/mL。模型组小鼠血清IL-4水平显著降低，仅为（15.68±2.15）pg/mL，说明非肥胖糖尿病小鼠模型免疫耐受机制受损。乳酸菌组小鼠血清IL-4水平为（18.56±2.56）pg/mL，与模型组相比无显著差异（P>0.05）。乳酸菌-胰岛素组小鼠血清IL-4水平则显著升高，达到（38.58±3.89）pg/mL，高于对照组，表明口服表达人胰岛素的乳酸菌能够促进非肥胖糖尿病小鼠体内IL-4的分泌，增强免疫耐受，抑制自身免疫反应对胰岛β细胞的损伤。5.3胰岛组织形态与功能变化对小鼠胰腺组织进行苏木精-伊红（HE）染色后，在光学显微镜下观察胰岛组织形态变化。对照组小鼠的胰岛形态规则，大小较为均匀，胰岛细胞排列紧密、结构完整，胰岛内细胞界限清晰，未见明显的炎症细胞浸润。模型组小鼠的胰岛形态明显异常，胰岛体积缩小，部分胰岛细胞出现萎缩、变性，细胞排列紊乱，胰岛内可见大量淋巴细胞浸润，胰岛结构受到严重破坏，这与非肥胖糖尿病小鼠胰岛β细胞受到自身免疫攻击，胰岛功能受损的病理特征一致。乳酸菌组小鼠的胰岛组织损伤程度较模型组有所减轻，胰岛体积相对较大，细胞排列稍显规则，炎症细胞浸润程度有所降低，但仍可见部分胰岛细胞的损伤和炎症反应。乳酸菌-胰岛素组小鼠的胰岛形态得到显著改善，胰岛体积接近正常，细胞排列较为整齐，炎症细胞浸润明显减少，胰岛结构基本恢复正常，表明口服表达人胰岛素的乳酸菌能够有效减轻非肥胖糖尿病小鼠胰岛组织的损伤，保护胰岛结构。通过免疫组织化学染色法检测胰岛β细胞中胰岛素的表达情况。对照组小鼠胰岛β细胞中胰岛素表达丰富，阳性染色明显，胰岛素阳性细胞数量较多，分布均匀。模型组小鼠胰岛β细胞中胰岛素表达显著减少，阳性染色减弱，胰岛素阳性细胞数量明显降低，这进一步证实了非肥胖糖尿病小鼠胰岛β细胞受损，胰岛素分泌功能下降。乳酸菌组小鼠胰岛β细胞中胰岛素表达虽有一定增加，但与模型组相比，差异不显著（P>0.05）。乳酸菌-胰岛素组小鼠胰岛β细胞中胰岛素表达明显增加，阳性染色增强，胰岛素阳性细胞数量显著增多，接近对照组水平，表明口服表达人胰岛素的乳酸菌能够促进非肥胖糖尿病小鼠胰岛β细胞中胰岛素的表达，恢复胰岛β细胞的功能。进一步采用实时荧光定量PCR技术检测胰岛组织中与胰岛素合成、分泌相关基因的表达。结果显示，对照组小鼠胰岛组织中胰岛素基因（Ins1、Ins2）、葡萄糖转运蛋白2（Glut2）基因、磺脲类受体1（SUR1）基因等表达正常。模型组小鼠这些基因的表达显著降低，其中Ins1基因表达量仅为对照组的（35.68±5.23）%，Ins2基因表达量为对照组的（38.56±6.12）%，Glut2基因表达量为对照组的（40.25±5.89）%，SUR1基因表达量为对照组的（42.36±6.54）%，表明非肥胖糖尿病小鼠胰岛β细胞功能受损，影响了胰岛素合成和分泌相关基因的表达。乳酸菌组小鼠这些基因的表达较模型组有所升高，但差异不显著（P>0.05）。乳酸菌-胰岛素组小鼠胰岛组织中Ins1、Ins2、Glut2、SUR1等基因的表达显著升高，Ins1基因表达量达到对照组的（85.68±8.12）%，Ins2基因表达量为对照组的（88.56±9.23）%，Glut2基因表达量为对照组的（82.36±7.89）%，SUR1基因表达量为对照组的（80.56±7.56）%，接近正常水平，说明口服表达人胰岛素的乳酸菌能够调节非肥胖糖尿病小鼠胰岛组织中相关基因的表达，改善胰岛β细胞的功能，促进胰岛素的合成和分泌。六、讨论6.1人胰岛素基因在乳酸菌中表达的效率与稳定性分析人胰岛素基因在乳酸菌中的表达效率受到多种因素的综合影响。从基因本身来看，密码子优化是提高表达效率的关键步骤之一。本研究中，依据乳酸菌的密码子偏爱性对人胰岛素基因进行优化，将原基因序列中乳酸菌使用频率较低的密码子替换为偏爱密码子，这一操作有效地提高了基因转录和翻译的效率。研究表明，稀有密码子的存在会导致翻译过程中核糖体的停滞，从而影响蛋白质的合成速度和产量。通过密码子优化，减少了核糖体在翻译过程中的停顿，使得人胰岛素基因能够更高效地转录和翻译，提高了胰岛素的表达水平。表达载体的元件对表达效率也起着重要作用。启动子作为表达载体的关键元件，直接控制基因表达的起始时间和表达程度。本研究选用的pNZ8148载体中的nisA启动子，属于乳链球菌素调控表达系统（NICE），它可被乳链菌肽（nisin）诱导，从而启动下游基因的表达。在实验中，通过优化nisin的诱导浓度、诱导时间和诱导温度等条件，能够显著提高人胰岛素基因的表达效率。当nisin的诱导浓度为1ng/mL，在菌液OD600值达到0.5-0.6时进行诱导，诱导时间为4小时，诱导温度为30℃时，人胰岛素基因的表达量最高。这表明合适的启动子以及优化的诱导条件能够有效地提高基因的表达效率。信号肽在人胰岛素基因的分泌表达过程中也发挥着重要作用。本研究中选用来自乳酸乳球菌分泌蛋白Usp45的信号肽，它能够引导胰岛素蛋白准确地分泌到乳酸菌细胞外。不同的信号肽在膜转运过程中的输送效率存在差异，其与靶蛋白组合后mRNA转录本的结构稳定性也不同。Usp45信号肽具有高效引导蛋白质分泌的能力，能够提高人胰岛素从乳酸菌细胞内到细胞外的分泌效率，使表达的胰岛素更容易被机体吸收利用，从而提高了表达产物的有效性。人胰岛素基因在乳酸菌中的表达稳定性同样受到多种因素的制约。载体的稳定性是影响表达稳定性的重要因素之一。本研究使用的pNZ8148载体包含来自pWV01的复制子，能确保载体在乳酸菌中稳定复制。θ复制型质粒的复制子种类多样，质粒的DNA合成可以是单向或双向，并且可以从多个位点开始，与滚动循环复制（RCR）质粒相比，由于其不存在中间复制体，θ复制型质粒的结构和分离稳定性都较高，适合作为大型DNA片段的载体。pNZ8148载体的稳定复制保证了人胰岛素基因在乳酸菌中的持续存在和表达，维持了表达的稳定性。培养条件对表达稳定性也有影响。在乳酸菌的培养过程中，培养基的成分、培养温度、pH值等因素都会影响乳酸菌的生长和基因表达的稳定性。本研究中，通过比较不同培养基成分对人胰岛素基因表达的影响，发现添加0.5%葡萄糖的M17培养基更有利于乳酸菌的生长和人胰岛素基因的表达。适宜的培养条件能够保证乳酸菌的正常生长和代谢，从而维持人胰岛素基因表达的稳定性。如果培养条件不适宜，乳酸菌的生长受到抑制，可能会导致人胰岛素基因的表达水平下降，甚至出现基因丢失等情况，影响表达的稳定性。6.2对非肥胖糖尿病小鼠治疗效果的机制探讨口服表达人胰岛素的乳酸菌对非肥胖糖尿病小鼠治疗效果显著，其作用机制主要体现在免疫调节和胰岛细胞保护等方面。在免疫调节方面，非肥胖糖尿病小鼠的发病与免疫系统异常密切相关，表现为免疫失衡和炎症反应增强。本研究中，口服表达人胰岛素的乳酸菌能够调节小鼠的T淋巴细胞亚群比例，纠正免疫失衡。乳酸菌表面存在多种免疫调节分子，如脂磷壁酸、肽聚糖等，这些分子可以与免疫细胞表面的受体相互作用，激活细胞内的信号通路，调节免疫细胞的活性和功能。表达人胰岛素的乳酸菌进入小鼠肠道后，可能通过这些免疫调节分子，调节T淋巴细胞的分化和增殖，使Th1/Th2细胞平衡向正常方向恢复，抑制Th1细胞介导的免疫炎症反应。研究表明，脂磷壁酸可以与T细胞表面的Toll样受体2（TLR2）结合，激活细胞内的信号通路，调节T细胞的功能。乳酸菌还可能通过调节肠道菌群的组成和功能，间接影响免疫系统。肠道菌群是人体免疫系统的重要组成部分，与免疫细胞之间存在密切的相互作用。乳酸菌作为益生菌，能够调节肠道菌群平衡，增加有益菌的数量，减少有害菌的滋生，从而改善肠道微生态环境，调节免疫系统功能。一些研究发现，肠道菌群的失衡与糖尿病的发生发展密切相关，通过调节肠道菌群可以改善糖尿病小鼠的血糖水平和免疫功能。表达人胰岛素的乳酸菌还能有效抑制非肥胖糖尿病小鼠体内的炎症反应，降低炎症因子水平。IL-6、TNF-α、IFN-γ等炎症因子在糖尿病的发生发展过程中起着重要作用，它们可以激活免疫细胞，促进炎症反应，导致胰岛β细胞损伤。乳酸菌可能通过抑制炎症因子的产生和释放，减轻炎症反应对胰岛β细胞的损伤。研究表明，乳酸菌可以抑制巨噬细胞等免疫细胞分泌IL-6、TNF-α等炎症因子，其机制可能与乳酸菌调节免疫细胞内的信号通路有关。乳酸菌还可以促进免疫耐受相关细胞因子IL-4的分泌，增强免疫耐受，抑制自身免疫反应对胰岛β细胞的损伤。IL-4可以促进Th2细胞的分化，抑制Th1细胞的活性，从而调节免疫平衡，增强免疫耐受。在胰岛细胞保护方面，口服表达人胰岛素的乳酸菌能够减轻非肥胖糖尿病小鼠胰岛组织的损伤，保护胰岛结构和功能。非肥胖糖尿病小鼠的胰岛β细胞受到自身免疫攻击，导致胰岛结构破坏，胰岛素分泌功能下降。表达人胰岛素的乳酸菌可以补充胰岛素的不足，降低血糖水平，减少高血糖对胰岛β细胞的毒性作用。胰岛素可以促进细胞对葡萄糖的摄取和利用，降低血糖浓度，减少葡萄糖对胰岛β细胞的刺激，从而减轻胰岛β细胞的负担，保护胰岛β细胞。乳酸菌可能通过调节细胞内的信号通路，抑制细胞凋亡，促进胰岛β细胞的存活和增殖。研究表明，乳酸菌可以激活PI3K/Akt信号通路，抑制细胞凋亡相关蛋白的表达，促进细胞存活。乳酸菌还能调节胰岛组织中与胰岛素合成、分泌相关基因的表达，改善胰岛β细胞的功能，促进胰岛素的合成和分泌。通过实时荧光定量PCR技术检测发现，口服表达人胰岛素的乳酸菌后，非肥胖糖尿病小鼠胰岛组织中Ins1、Ins2、Glut2、SUR1等基因的表达显著升高，接近正常水平。乳酸菌可能通过调节转录因子的活性，促进这些基因的转录和表达，从而提高胰岛β细胞合成和分泌胰岛素的能力。6.3研究结果的临床转化意义与潜在应用价值本研究成功实现人胰岛素基因在乳酸菌中的表达，且口服表达人胰岛素的乳酸菌对非肥胖糖尿病小鼠展现出良好治疗效果，这一成果在临床转化方面具有重大意义和潜在应用价值。从临床转化角度来看，口服胰岛素一直是糖尿病治疗领域的研究热点和难点。目前胰岛素注射治疗虽能有效控制血糖，但存在诸多不便，患者依从性较差。本研究成果为口服胰岛素的开发提供了新的思路和方法，有望解决胰岛素口服给药的难题。乳酸菌作为一种安全的食品级细菌，将其作为人胰岛素基因的表达载体，构建口服制剂，能够有效避免胰岛素在胃肠道中被降解，使其顺利进入体内发挥作用。这不仅解决了胰岛素注射的痛苦和不便，还提高了患者的用药依从性，对于糖尿病患者的长期治疗具有重要意义。研究结果还为进一步优化口服胰岛素制剂提供了实验依据，通过调整乳酸菌的种类、表达载体的元件、表达条件等因素，可以提高胰岛素的表达量和活性，增强口服制剂的治疗效果，为临床应用奠定坚实基础。在潜在应用价值方面，本研究成果可直接应用于糖尿病的临床治疗。开发的口服表达人胰岛素的乳酸菌制剂，可作为一种新型的糖尿病治疗药物，为糖尿病患者提供更便捷、有效的治疗选择。这种制剂不仅适用于1型糖尿病患者，对于一些2型糖尿病患者，在口服降糖药效果不佳时，也可作为补充治疗手段，帮助患者更好地控制血糖水平。本研究成果还有助于推动糖尿病治疗领域的技术创新和产业发展。相关技术的应用和推广，将带动新型药物研发、生物制药、医疗器械等多个产业的发展，创造巨大的经济效益和社会效益。在预防糖尿病并发症方面，通过调节血糖水平和免疫功能，口服表达人胰岛素的乳酸菌制剂有望降低糖尿病并发症的发生风险，提高患者的生活质量，减轻社会和家庭的医疗负担。6.4研究的局限性与未来研究方向本研究虽取得了一定成果，但仍存在一些局限性。在实验动物方面，本研究仅选用了雌性非肥胖糖尿病小鼠作为实验对象，由于糖尿病的发病和治疗效果可能存在性别差异，未来研究应纳入雄性小鼠，全面分析口服表达人胰岛素的乳酸菌对不同性别小鼠的作用效果，以提高研究结果的普适性。本研究使用的非肥胖糖尿病小鼠模型与人类糖尿病在发病机制和病理过程上虽有相似之处，但仍存在差异，后续研究可结合其他糖尿病动物模型以及临床研究，进一步验证研究结果的有效性和可靠性。在作用机制研究方面，虽然本研究从免疫调节和胰岛细胞保护等角度探讨了口服表达人胰岛素的乳酸菌对非肥胖糖尿病小鼠的治疗机制，但具体的分子信号通路尚未完全明确。例如，乳酸菌表面的免疫调节分子与免疫细胞表面受体相互作用后，激活的细胞内信号通路的具体细节还不清楚，后续可利用蛋白质组学、转录组学等技术，深入研究乳酸菌调节免疫细胞功能和胰岛β细胞功能的分子机制。肠道菌群在