61　选择性必修3　第九单元　第52讲　基因工程的基本工具和基本操作程序

选择性必修3生物技术与工程第九单元生物技术与工程第52讲基因工程的基本工具和基本操作程序课标要求1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。3.实验：DNA的提取和鉴定。4.实验：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。考点1重组DNA技术的基本工具一、基因工程的概念二、重组DNA技术的基本工具1．限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)1．(选择性必修3P71“旁栏思考”)存在于原核生物中的限制酶的作用是_____________________________________________________。2．(选择性必修3P71“正文”)用两种不同的限制酶切割目的基因的优点是________________________________________________________________。切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害防止质粒和目的基因的自我环化及质粒和目的基因的反向连接2．DNA连接酶E.coli

DNA连接酶可连接具有黏性末端的DNA片段，而连接具有平末端的DNA片段的效率要远远___于T4DNA连接酶。T4DNA连接酶可连接具有黏性末端的DNA片段，而连接具有平末端的DNA片段的效率要远远___于E.coliDNA连接酶。低高3．载体3．(选择性必修3P72“旁栏思考”)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用不相同，主要区别在于___________________________________________________________________________________________。4．(选择性必修3P73“正文”)实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通“质粒载体”的条件外，还应具有的条件是________________________________________________________。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是将单个的脱氧核苷酸连接到脱氧核苷酸链上对靶细胞具有较高的转化效率；不能增殖，对细胞无害限制酶的选择原则(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图可选择PstⅠ。②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，防止破坏目的基因，如图不能选择SmaⅠ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种限制酶的切割位点，而且这两种限制酶切割后不会破坏标记基因)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类(3)根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶，图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。1．基因工程的原理是基因重组，此种变异是定向的。(

)2．重组DNA技术的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。(

)提示：载体是DNA重组技术所需的工具，不是工具酶。3．DNA连接酶“缝合”目的基因与载体之间的氢键。(

)提示：DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。4．大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。(

)5．作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。(

)√××√√CRISPR—Cas9基因组编辑系统由向导RNA(也叫SgRNA)和Cas9蛋白组成，向导RNA识别并结合靶基因DNA，Cas9蛋白切断双链DNA形成两个末端。这两个末端通过“断裂修复”重新连接时通常会有个别碱基对的插入或缺失，从而实现基因敲除，原理如图所示。CRISPR－Cas9基因组编辑技术有时存在编辑出错而造成脱靶，脱靶最可能原因是_____________________________________________________________________________________________________________________________________________。其他DNA序列也含有与向导RNA(SgRNA)互补配对的序列，造成向导RNA(SgRNA)错误结合DNA序列而脱靶，而且SgRNA的序列越短，脱靶率会越高1．下图1表示某DNA片段及限制酶酶切位点，用限制酶XhoⅠ和SalⅠ分别处理该DNA片段后，酶切产物电泳分离的结果如图2所示。下列叙述错误的是(

)1基因工程工具酶的应用A．不同的限制酶切割DNA后形成的黏性末端可能相同B．限制酶XhoⅠ与限制酶SalⅠ识别的核苷酸序列不同C．泳道①②分别是限制酶XhoⅠ和限制酶SalⅠ处理得到的产物D．用限制酶XhoⅠ和限制酶SalⅠ同时处理该DNA片段，可得到6种电泳产物C

[不同的限制酶识别的序列不同，但可能会产生相同的黏性末端，A正确；结合图1和图2可知，限制酶XhoⅠ与限制酶SalⅠ识别的核苷酸序列不同，B正确；由题图分析可知，泳道①②分别是限制酶SalⅠ和限制酶XhoⅠ处理得到的产物，C错误；用限制酶XhoⅠ和限制酶SalⅠ同时处理该DNA片段，该片段共有5个酶切位点，可得到6种电泳产物，D正确。]√2．(2025·广东深圳模拟)下表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点(箭头表示相关酶的切割位点)。下列有关说法正确的是(

)A．BamHⅠ切割的是氢键，AluⅠ切割的是磷酸二酯键B．能被BamHⅠ切割的序列也能被Sau3AⅠ识别和切割C．限制酶AluⅠ和SmaⅠ切割产生的末端属于黏性末端D．上述限制酶切割产生的任意末端均可被T4DNA连接酶连接√限制酶AluⅠBamHⅠSmaⅠSau3AⅠ识别序列及切割位点B

[BamHⅠ和AluⅠ切割的都是磷酸二酯键，A错误；BamHⅠ的识别序列是-GGATCC-，Sau3AⅠ的识别序列是GATC，前者的识别序列比后者长，且包括后者的识别序列，所以能被BamHⅠ切割的序列也能被Sau3AⅠ识别和切割，B正确；限制酶AluⅠ和SmaⅠ切割产生的末端属于平末端，C错误；T4DNA连接酶既可以连接具有黏性末端的DNA片段，又可以连接具有平末端的DNA片段，只是连接平末端的效率相对较低，但不是任意末端都可被T4DNA连接酶连接，如AluⅠ产生的末端和BamHⅠ产生的末端，不可被T4DNA连接酶连接，D错误。]3．表面展示技术是通过重组DNA技术，将外源蛋白与细胞表面的蛋白质组装成融合蛋白，从而可展示在细胞表面。回答下列问题。(1)若要将芽孢表面蛋白基因cotB与外源的绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，下图中最适合通过绿色荧光(绿色荧光蛋白在紫外光下会产生绿色荧光)确定融合蛋白成功表达的是___________。2基因工程载体的应用A

B

C

D注：AmpR为氨苄青霉素抗性基因；→表示转录方向；UAG，UAA，UGA是终止密码子，AUG是起始密码子。(2)芽孢表面蛋白是实现表面展示技术的关键蛋白，结合上述材料，试分析该蛋白在表面展示技术中的作用是_____________________________________________________________________________。(3)导入基因表达载体后的芽孢杆菌接种在含有________的固体培养基上，以获得携带载体的单菌落，该过程被称为微生物的________培养。(4)培养基中可能既有含基因表达载体的单菌落，也有含________的单菌落，因此还需要对DNA进行提取，常用酒精初步分离DNA和蛋白质，这里酒精的作用原理是____________________________。(5)若要确定表面展示技术在芽孢杆菌上构建成功，应在紫外光环境下对其进行_______________水平的检测。解析：(1)若要将芽孢表面蛋白基因cotB与外源的绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，则需要将cotB和gfp一起表达，即使用一个启动子和终止子，并且cotB在前，gfp在后，才能通过绿色荧光(绿色荧光蛋白在紫外光下会产生绿色荧光)确定融合蛋白成功表达，为了能够顺利表达gfp，则中间不能出现终止密码子，转录时模板链的方向应是3′到5′，D中mRNA中间会出现终止密码子，只有C符合题意。(2)蛋白在表面展示技术中的作用是芽孢表面蛋白是可以定位在细胞表面的，在与外源蛋白形成融合蛋白后，可将外源蛋白展示(定位在芽孢杆菌表面)。(3)由于表达载体中含有AmpR基因，若转基因成功，该芽孢杆菌能够在含有氨苄青霉素的培养基上生长。该过程被称为微生物的选择培养。(4)培养基中可能既有含基因表达载体的单菌落，也有含空载体(不含目的基因的载体)的单菌落，因此还需要对DNA进行提取，然后进行鉴定，由于DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，所以可以用酒精初步分离DNA和蛋白质。(5)由于绿色荧光蛋白在紫外光下会产生绿色荧光，所以可在紫外光环境下对芽孢杆菌进行个体(细胞)水平进行检测。答案：(1)C

(2)芽孢表面蛋白是可以定位在细胞表面的，在与外源蛋白形成融合蛋白后，可将外源蛋白展示(定位在芽孢杆菌表面)

(3)氨苄青霉素(Amp)选择(4)空载体DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精(5)个体(细胞)考点2基因工程的基本操作程序一、目的基因的筛选与获取1．筛选合适的目的基因(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变____________或获得_____________等的基因。主要是指____________的基因。(2)筛选目的基因的方法：从相关的已知____________清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。受体细胞性状预期表达产物编码蛋白质结构和功能2．利用PCR获取和扩增目的基因(1)原理：DNA半保留复制。(2)条件：DNA模板、2种引物、________________________和4种脱氧核苷酸。耐高温的DNA聚合酶(3)PCR反应过程(4)PCR产物的鉴定：常采用__________________来鉴定。琼脂糖凝胶电泳1．(选择性必修3P78“图3-5”)PCR反应体系中需要同时加入两种引物的原因是__________________________________________________________________________________________________________。DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链，且DNA两条单链的序列不同，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增二、基因表达载体的构建——基因工程的核心1．构建基因表达载体的目的(1)使目的基因在受体细胞中___________，并且可以遗传给下一代。(2)使目的基因能够______和发挥作用。稳定存在表达2．基因表达载体的组成3．基因表达载体的构建过程三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定2．(选择性必修3P82“正文”)转基因抗虫棉培育过程中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有__________________、_______________________________。抗原—抗体杂交采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫(1)目的基因的获取方法①利用PCR获取和扩增目的基因。②人工合成目的基因a．逆转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成双链DNA，其过程如下：b．化学合成法：依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后直接合成目的基因，其过程如下：③从基因文库中获取目的基因根据目的基因的有关信息，例如：根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。(2)基因表达载体中启动子、终止子的来源①如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，目的基因中已含有启动子、终止子，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。

②如果目的基因是通过逆转录或人工方法合成的，则目的基因中不含启动子和终止子。因此，构建基因表达载体时，在目的基因与质粒结合之前，需要在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。1．目的基因主要指编码蛋白质的基因。(

)2．Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。(

)3．DNA复制的引物使DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸。(

)提示：DNA复制的引物使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。√√×4．PCR扩增完成后，常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。(

)5．随着转化方法的研究，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。(

)6．检测目的基因是否表达可用抗原—抗体杂交技术。(

)√√√1．设计引物是PCR技术成功的关键步骤之一。下图为某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)，请判断是否合理并说明理由。(1)第1组：_________________________________________________；(2)第2组：________________________________________________________________。不合理，引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效不合理，引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效2．URA3基因位于酵母菌5号染色体上，编码的酶参与酵母菌尿嘧啶核苷酸的合成。科研人员利用基因工程敲除酵母菌中的URA3基因，以获得尿嘧啶营养缺陷型酵母菌。从获得的转基因酵母菌中筛选出了多株尿嘧啶营养缺陷型酵母菌，现需验证这些菌株是因URA3基因缺失而导致的。选择实验材料写出实验设计思路。实验材料：转基因酵母菌、完全培养基、尿嘧啶缺陷型培养基、含URA3基因的重组质粒、不含URA3基因的空质粒。实验设计思路：________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。将转基因酵母菌随机分为两组，一组导入含有URA3基因的重组质粒，一组导入不含URA3基因的空质粒，再将两组酵母菌接种到尿嘧啶缺陷型培养基，观察生长状况1．β-丙氨酸作为重要的中间体，广泛应用于医药、食品、化工等领域。L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)能够催化β-丙氨酸的生成，但天然PanD活力(酶活力是指酶催化一定化学反应的能力)较低且易失活。研究人员运用蛋白质工程对酶基因进行分子改造，在未知PanD三维结构和功能关系的情况下，通过易错PCR技术引入随机突变，再进行定向筛选，最终获得活力和稳定性均较高的PanD。回答下列问题：1PCR技术及应用(1)易错PCR与普通PCR相似，每次循环也包括了_______________三步，但可通过改变PCR反应条件来提高碱基错配的概率。在PCR反应体系中，Mg2＋可以提高已发生错配区域的稳定性，Mn2＋可以降低DNA聚合酶对底物的专一性。因此，与普通PCR相比，易错PCR的反应体系中应适当__________(填“提高”或“降低”)Mg2＋浓度、__________(填“提高”或“降低”)Mn2＋浓度。通过多轮的易错PCR及筛选，可以获取所需的PanD基因。(2)研究人员对比改造前后的两种PanD，发现改造后的PanD的第305位氨基酸由赖氨酸突变为丝氨酸，推测突变后酶活力升高的原因是_________________________________________________。(3)为将能表达高活力PanD的大肠杆菌应用于工业发酵生产β-丙氨酸，研究人员还探究了发酵的最佳反应条件，研究中发现了随着底物浓度升高，β-丙氨酸产量下降的现象，推测其原因可能是__________________________________________________________________。因此在工业生产中，要采用______________(填“一次足量添加”或“多次分批补料”)的投料策略。解析：(1)易错PCR与普通PCR相似，每次循环也包括了变性、复性、延伸三步。PCR技术是指通过DNA的双链复制，在耐高温的DNA聚合酶的催化下，遵循碱基互补配对原则，扩增DNA片段。耐高温的DNA聚合酶负责将碱基与模板链正确的互补配对，Mn2＋可以降低DNA聚合酶对底物的专一性，也就是说Mn2＋能提高碱基与模板链的错配的概率，增大突变率；非互补的碱基对由于氢键不易形成，稳定性差，Mg2＋可以提高已发生错配区域的稳定性，因此与普通PCR相比，易错PCR的反应体系中应适当提高Mg2＋浓度和Mn2＋浓度。(2)组成PanD的第305位氨基酸由赖氨酸突变为丝氨酸后，由于该酶的氨基酸种类改变，导致酶的空间结构发生改变，结构决定功能，进而使酶活力升高。(3)将能表达高活力PanD的大肠杆菌应用于工业发酵生产β-丙氨酸，随着底物浓度升高，发酵液浓度增加，进而使大肠杆菌失水较多，甚至死亡，不能高效地表达高活力PanD，为了维持发酵液的浓度，在工业生产中，要采用多次分批补料的投料策略。答案：(1)变性、复性、延伸提高提高(2)组成PanD的氨基酸种类改变，导致酶的空间结构发生改变，进而使酶活力升高(3)随着底物浓度升高，发酵液浓度增加，进而使大肠杆菌失水较多，甚至死亡，不能高效地表达高活力PanD多次分批补料2．(2025·广东汕头模拟)科研人员利用细胞工程和基因工程技术生产抗狂犬病毒抗体，基本流程如图所示。下列叙述错误的是(

)A．过程③是获得转基因大肠杆菌的核心工作B．细胞A为已免疫B淋巴细胞并且可以从小鼠的脾中获取C．检测V1基因在大肠杆菌体内是否成功表达可采用抗原—抗体杂交法D．从大肠杆菌的培养液中提取的抗体可直接制成用于注射的药剂进行临床使用2基因工程的基本操作程序√D

[过程③表示基因表达载体的构建，是获得转基因大肠杆菌的核心工作，A正确；分析题图可知，细胞A是从已免疫的小鼠体内分离得到的，是已免疫的B淋巴细胞，可以从小鼠的脾中获取，B正确；要检测V1基因是否表达成功，需要从大肠杆菌细胞中提取有关蛋白质，用抗原—抗体杂交的方法来检测，C正确；大肠杆菌产生的抗体没有经过内质网和高尔基体的加工，故从大肠杆菌细胞内提取的抗体可能没有生物活性，不可直接制成用于注射的药剂进行临床使用，D错误。]3．(2023·广东卷)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。回答下列问题：(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与__________植株的种子大小相近。(2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备_____________。(3)转化后，T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图)，用于后续验证突变基因与表型的关系。①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了____________________________________。②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约________%的培养基中的幼苗继续培养。③将②中选出的T2代阳性植株________(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性内切核酸酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。解析：(1)根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。(2)利用PCR技术扩增DAI基因后，应该用同种限制性内切核酸酶对DAI基因和载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。(3)①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌(T-DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因)液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基(含有卡那霉素)上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DAI基因，由于T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中的幼苗继续培养。③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株，即阳性率达到100%，则该培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合题图中的数据分析可知，经限制酶X切割后，野生型只有长度为150bp的基因片段，突变型有长度为50bp和100bp的基因片段，电泳图如答案所示。答案：(1)野生型(2)载体(基因表达载体)启动子和终止子(3)①DAI基因和卡那霉素抗性基因②75

③自交1004．科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。(1)与图甲中启动子结合的酶是________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有____________________(答出2个结构即可)。(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的______(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了___________，条带2所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。解析：(1)基因表达载体的构建中启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为载体必须具备的条件：要具有限制酶的切割位点；要有标记基因(如抗性基因)，以便于重组后重组质粒的筛选；能在宿主细胞中稳定存在并复制；是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。(2)用PCR扩增分析法确定重组质粒中目的基因插入方向是否正确时，常设计一对引物，一个引物与目的基因序列互补，另一个引物与质粒序列互补，两引物延伸方向相反，以扩增出两引物间的序列，若插入方向正确，则可扩增出相应序列，反之，则不能扩增出相应序列，故选用的引物应为F2、R1或F1、R2，若选用引物F1、R1，不论目的基因插入方向是否正确，都可扩增出目的基因序列。因为J基因的b链为转录的模板链，启动子在左侧，所以转录方向为从左到右，由于转录沿模板链3′到5′端方向合成RNA，所以J基因b链左侧为3′端，引物要与DNA的3′端互补配对，所以F1与b链互补，a链也与b链互补，由此推知引物F1与a链相应部分序列相同。(3)抗J蛋白抗体和抗V5抗体均能检测到条带1，说明条带1为J-V5融合蛋白，条带2仅能由抗J蛋白抗体检测到，说明该蛋白仅含J蛋白，不含V5标签，故条带2检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。答案：(1)RNA聚合酶限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等(2)F2和R1(或F1和R2)

a链(3)J-V5融合蛋白不是考点3

(探究•实践)DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定一、DNA的粗提取与鉴定1．实验原理2．实验步骤二、DNA片段的扩增及电泳鉴定1．实验基础(1)PCR原理：利用了__________________原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。(2)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷______的电极移动，这个过程就是电泳。(3)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的____________等有关。DNA的热变性相反大小和构象2．实验步骤(1)DNA片段的扩增(2)DNA片段的电泳鉴定①根据待分离DNA片段的大小，用____________配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在_________或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的___________混匀。②将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。③待凝胶溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝胶放入________内。电泳缓冲液沸水浴核酸染料电泳槽④将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶___________为宜。⑤将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用____________将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。⑥接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。⑦取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。1mm微量移液器1．DNA粗提取中的注意事项(1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。(2)加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。(3)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。(4)提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。(5)在DNA进一步提纯时，选用冷却的体积分数为95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。2．DNA片段的扩增及电泳鉴定的注意事项(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。(2)缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。(4)在进行操作时，一定戴好一次性手套。1．不同生物的DNA的提取方法有所不同，DNA提取的原理和实验流程大致相同(如图所示)。下列说法错误的是(

)A．破碎细胞在冷冻条件下进行，可将组织材料冻裂和降低DNA酶的活性B．溶于酒精中的可能有某些盐类、蛋白质、糖类或其他大分子物质C．DNA粗提取时离心需使用塑料离心管，用二苯胺试剂对离心结果进行鉴定D．鉴定絮状物中DNA时，需用2mol·L－1