微生物的菌种选育名称微生物学基础70课件

课程名称：微生物学基础微生物的菌种选育一、常见微生物（一）细菌工业常用微生物第一节工业常用微生物及要求醋杆菌属——食醋生产乳酸菌——酸奶生产芽孢杆菌属——益生菌制剂（二）酵母工业常用微生物啤酒酵母——酒类生产产朊假丝酵母——青贮饲料面包酵母——焙烤食品（三）霉菌工业常用微生物曲霉属——酱油、醋生产青霉属——抗生素生产根霉属——黄酒、白酒生产（四）放线菌工业常用微生物链霉菌——抗生素生产二、微生物工业对菌种的要求工业常用微生物01原料廉价，生长迅速，目的产物产量高02易控制培养条件，发酵周期较短03抗杂菌和噬菌体的能力强04不易变异和退化，不产生任何有害物质和毒素选育方法:自然选育诱变育种基因工程育种选育目的：1、产生新的生物活性物质2、改变产品组分，改进质量3、简化工艺条件、缩短生产周期4、适应新的原材料5、提高产量菌种的选育菌种选育工作任务：为某白酒企业选育一株高产淀粉酶的菌种采样筛选分离发酵优化诱变处理自然选育任务1产淀粉酶菌株的筛选采样富集培养筛选分离目标菌1.采样菌种选育土壤河流大海土壤是微生物的大本营，自然界选育菌种的主要来源1.采样菌种选育选择地点中性偏碱的土壤细菌和放线菌酸性红土壤和森林土壤霉菌果园、菜园等含碳水化合物土壤酵母和霉菌确定时间雨量不多，温度适中的秋初水分、温度、通风、pH1.采样菌种选育无菌采样取离地面50-150mm的土标注样品种类、采样日期、地点及其地理、生态参数2.富集培养菌种选育目的提高目的菌的数量，增加筛选分离的概率方法（1）控制培养基的营养成分（碳源：糖类、纤维素、淀粉、CO2）（2）控制培养条件（好氧或厌氧、温度、pH）（3）添加抑制因子（根据菌种特性）3.筛选分离菌种选育目的培养微生物，筛选出可疑目的菌株原理目标菌代谢产物产生酶，与选择性培养基中成分发现生理生化反应方法透明圈3.筛选分离菌种选育01平板划线法：简单、快捷3.筛选分离菌种选育02平板稀释涂布法。菌落单一均匀4.目标菌菌种选育方法：

分光光度法测定测酶活透明圈目的：进行生产性能的测定，确定适合生产要求的目的菌株。步骤：

初筛（1株1瓶）复筛（1株3瓶）再次复筛（1株3瓶）单株纯种分离生产性能试验毒性试验菌种鉴定二、特定产物菌株的鉴定菌种选育平板反应快速检出法纸片培养显色法透明圈法变色圈法生长圈法抑制圈法原理：以饱浸含有某种指示剂的固体培养基的滤纸置于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，用接种环取适量细胞悬液接于滤纸上，保温培养，得到分散的单菌落，菌落周围产生对应的颜色改变，由指示剂变色圈和菌落直径之比可知产量性状的相对大小。指示剂待检菌接种培养菌种选育纸片培养显色法指示剂指示剂原理：菌株生产在过程中产生特定的产物，分解培养基中某特定成分，即可形成透明圈，可被检测出淀粉淀粉待检菌涂布培养淀粉酶淀粉菌种选育透明圈法淀粉淀粉待检菌涂布培养淀粉酶淀粉碘液碘液菌种选育变色圈法原理：直接用显色剂或指示剂掺入培养基中，或喷洒已生长菌落的培养基表面，使其形成显色圈而被检出。-A工具菌-A工具菌待检菌涂布培养+A单菌落工具菌菌种选育生长圈法原理：将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物质的平板上进行培养，若分离的菌株能在一般的培养条件下（缺乏上述营养要求物质）生长而合成该营养物，工具菌因获得所需的营养而生长，在该菌株的菌落周围形成了浑浊的生长圈。-A单菌落培养菌种选育抑制圈法原理：将待检菌涂布于含高浓度的工具菌的平板上进行培养，若分离的菌株能生长且分泌产生某些抑制工具菌生长的物质B，工具菌因生长受到抑制，在该菌株的菌落周围形成工具菌不能生长的抑制圈。工具菌工具菌待检菌涂布培养B工具菌菌种选育三、微生物实验操作技能1、无菌取样2、检样稀释3、涂布法实验二：诱变育种利用筛选培养基分离能产葡聚糖酶的菌株，采用测定透明圈大小的方法比较各菌株的产酶能力旧知回顾实验原理：葡聚糖+刚果红菌悬液涂布葡聚糖+刚果红葡聚糖酶分解葡聚糖，形成透明圈实验结果观察实验结果产葡聚糖酶菌株透明圈直径（mm）01疑似菌株的判定依据：透明圈02疑似菌株的鉴别：圈出、编号、测量透明圈实验结果观察实验结果03实验结果分析：操作和结果思考：为什么会出现这样的实验结果？实验方案如何改进？诱变育种什么是诱变？青霉素生产菌诱变育种1927：MullerHJ.使用X射线在果蝇上发现了很大数量的突变体。诱变育种诱变育种：

是指利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变频提高，筛选出少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学实验之用。实验目的：促进目标菌株发生正突变，提高产酶（代谢产物）量，得到高产菌株诱变育种一、诱变育种试验设计和准备工作1、诱变前对出发菌株的了解（菌落类型）2、了解菌种的特性及其与生产性能的关系3、了解影响菌种生长繁殖的主要原因4、了解菌种有效产物中的各组分在代谢合成过程中与培养条件的关系5、建立准确、简便、快速检测产物的方法6、研究最佳的菌种保藏培养基和培养条件诱变育种的一般步骤原始菌株（出发菌株）细胞或孢子悬液制备诱变处理中间培养突变株分离诱变剂选择诱变育种初筛复筛生产性能试验同步培养(一)出发菌株的选择出发菌株：用来进行诱变处理的起始菌株诱变育种合适的出发菌株就是通过育种能有效地提高目标产物产量及质量的菌株首先应考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力。诱变育种

出发菌株的来源：主要有三方面(1)自然界直接分离到的野生型菌株

这些菌株的特点是：①酶系完整，染色体或DNA未损伤②生产性能差③诱变育种后正突变的可能性大(一)出发菌株的选择诱变育种(2)遗传特性好的菌株

这些菌株的特点是：①有一定的生产力②具有有利的性状，如生长速度快、营养要求低(3)对诱变剂敏感的菌株

这些菌株的特点是：①可提高变异频率(一)出发菌株的选择在诱变育种中，处理材料一般采用生理状态一致的单倍体、单核细胞，即菌悬液的细胞应尽可能达到同步生长状态——生理活性一致，称为同步培养。细胞的生理状态对诱变处理会产生很大的影响。细菌在对数期诱变处理效果较好；霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子影响不大，但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率。（二）同步培养诱变育种细菌一般要求培养至对数生长期，此时群体生长状态比较同步，比较容易变异，重复性较好。如亚硝基胍诱变时作用于复制叉处，生长旺盛的细胞中复制叉点较多，碱基类似物也在此时期比较容易进入DNA链中。霉菌处理使用分生孢子，应该将分生孢子在液体培养基中短时间培养，使孢子孵化，处于活化状态，并恰好未形成菌丝体，易于诱变。

诱变育种（三）单细胞(或单孢子)悬液的制备要求：①菌龄适宜：选择对数生长期的菌体②浓度适宜：霉菌孢子或酵母菌细胞的浓度大约为106-107个／mL，放线菌和细菌的浓度大约为108个/mL③均匀分散④一般可用生理盐水或缓冲溶液配制目的：细胞可均匀地接触诱变剂诱变育种诱变育种接种培养离心转入弃去上清液达到所需细胞浓度如何制备？出发菌株培养基离心管混匀生理盐水或缓冲液（四）诱变处理诱变育种诱变处理的步骤：1、选择合适的诱变剂2、确定诱变剂使用剂量常用诱变剂有两大类：

物理诱变剂

化学诱变剂

1、选择合适的诱变剂——诱变剂的种类诱变育种

物理诱变剂诱变育种

物理诱变剂诱变育种诱变育种

物理诱变剂电离辐射可引起DNA分子结构中碱基的变化则造成基因突变诱变育种

化学诱变剂种类：①烷化剂②碱基类似物③叠氮化合物57诱变育种1、选择合适的诱变剂——选择的原则诱变剂选择的原则：①根据菌种特性和遗传稳定性来选择诱变剂②在同样效果下，应选用最简便的因素；而在同样简便的条件下，应选用最高效的因素58诱变育种

２、选择合适的诱变剂量诱变剂量的确定：①正突变较多地出现在偏低的剂量中，而负变则较多地出现于偏高的剂量中；②最适的诱变剂量：在高诱变率的基础上既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量(五)中间培养中间培养也叫后培养：将诱变过的细胞进行培养，使得突变基因稳定、纯合并表达。诱变育种(六)分离和筛选突变株的分离：分离正突变的菌株初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主诱变育种

紫外线诱变诱变育种紫外线是阳光中波长为10～400纳米（nm）的光线，不可见光

紫外线诱变诱变育种诱变机理：形成T=T二聚体，也可形成C=T或C=C二聚体，导致DNA分子结构局部变形，严重干扰复制和转录

紫外线诱变诱变育种剂量选择：①一般采用15W紫外线杀菌灯，最有效波长为253.7nm。②灯与处理物的距离为15～30cm③照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜

紫外线诱变诱变育种特点：①穿透力不强，照射液厚度约0.5～1.0cm，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀②由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行，或者用黑色不透光布包裹培养实验二：产酶菌株的诱变实验

实验目的：提高产酶菌株的产酶量实验方法：紫外线诱变实验对象：产葡聚糖酶菌株实验任务：1.查阅资料，了解紫外线诱变的方法及注意事项2.制定实验方案

实验操作实验操作实验设备：诱变育种紫外线诱变操作步骤01出发菌株选择02前培养①制备营养丰富培养基②将菌体培养到最佳生理状态

产酶量较大的菌株诱变育种03制备菌悬液

①方法：生理盐水洗脱离心生理盐水冲洗离心

②要求：分散度：90％-95％菌体浓度：1×108mL-1（OD600=0.5）

诱变育种04紫外线照射

①预热:紫外灯预热20min

②加样：取4mL菌液加到直径9cm无菌培养皿内，放入无菌磁力搅拌子，置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处

③紫外线照射：打开紫外灯，开启皿盖，在搅拌下照射60s后用黑布包住诱变育种05暗箱培养①梯度稀释：紫外线照射后的菌悬液进行10倍梯度稀释至10-6②接种培养：选择后3个稀释度，平板涂布法接种至筛选培养基，36℃培养48h06分离将紫外线照射后的菌悬液用黑布包住，35℃培养2h诱变育种07筛选鉴定1、样液梯度稀释2、平板涂布法接种筛选培养基诱变育种08实验结果1、致死率=（对照组菌落数-实验组菌落数）/对照组菌落数*100%2、单菌落D/d值=透明圈直径Dmm/菌落直径dmm菌株编号诱变前D/d诱变后D/d表1单菌落D/d值比较一、菌种的衰退

菌种的衰退、复壮与保藏1.衰退：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。衰退的原因：①基因突变，②分离现象。常见的衰退现象：菌落和细胞形态的改变；生长速度缓慢，产孢子越来越少；抵抗力、抗不良环境能力减弱等。代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降；菌种的衰退、复壮与保藏复壮：使衰退的菌种恢复原来优良性状。菌种的复壮措施：

①纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。

②通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillusthuringiensis的复壮）；

③淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。

④采用有效的菌种保藏方法。二、菌种的复壮

1、菌种保藏的目的

①菌种存活，不丢失，不污染

②防止优良性状丧失

③随时为生产、科研提供优良菌种菌种的衰退、复壮与保藏三、菌种保藏2、菌种保藏的方法斜面保藏法穿刺保藏法沙土管干燥保藏法真空冷冻保藏法液氮保藏法低温保藏法菌种的衰退、复壮与保藏斜面低温保藏法方法：接种适宜斜面培养基→培养→4℃保藏原理：低温下，微生物代谢强度明显下降适用：各大类保藏期：3-6个月缺点：保存期短，传代多，易退化菌种的衰退、复壮与保藏菌种的衰退、复壮与保藏

半固体穿刺保藏法方法：适宜半固体→培养→4℃保藏原理：缺氧、低温适用：好气性细菌，酵母等保藏期：6-12个月步骤：用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌体，从柱状培养基中心自上而下刺入，至培养基的1/2处，待微生物生长良好后覆盖2-3mm无菌液体石蜡.石蜡可防止培养基失水又隔绝氧气,降低代谢.但不适用于可以石蜡为碳源的微生物.菌种的衰退、复壮与保藏菌种的衰退、复壮与保藏

砂土管干燥保藏法方法：将干燥砂粒与细土混合后灭菌制成砂土管，然后接种保藏。原理：无营养，缺氧，干燥适用：产孢子的丝状真菌、放线菌；有芽孢的细菌保藏期：2-10年或更长菌种的衰退、复壮与保藏河沙60目筛弃去大颗粒及杂质80目筛去掉细沙吸铁石吸去铁质10％～20％的盐酸浸泡24h去除有机物水洗至中性烘干或晒干土：取地面下40～60cm非耕作层贫瘠且粘性较小的土，研碎，100目过筛，水洗至中性，烘干。

将处理后的沙、土按质量比2∶1混合。混匀的沙土分装入安瓿管或小试管中，高度为1cm左右，塞好棉塞，121℃高压间歇灭菌2-3次，烘干备用。孢子或芽孢悬液→加入无菌砂土管中→干燥→封口→4-6℃保藏步骤：沙：菌种的衰退、复壮与保藏无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面。沙土管恢复培养菌种的衰退、复壮与保藏真空冷冻干燥保藏法：方法：菌种培养→用保护剂悬浮→加入安醅管中→低温冻结（-25—-40℃）→抽真空→真空封口→4-5℃保藏措施：低温、干燥，缺氧，保护剂适用：各大类保藏期：5-10年或更长菌种的衰退、复壮与保藏步骤1安瓿管的处理

直径8-10mm，长度不小于100mm，洗净高压灭菌备用。2保护剂

低分子和高分子化合物，如氨基酸、糖类、蛋白质等。常用的是脱脂奶和血清。3菌悬液制备

最适培养条件、生长后期。产孢子的微生物须适当延长培养时间以获得成熟的孢子。4冷冻干燥5安瓿管的保藏

4-5℃保藏菌种的衰退、复壮与保藏菌种的衰退、复壮与保藏

液氮超低温保藏法方法：菌悬液→加入保护剂→分装至安醅管中（0.2-1cm菌悬液）→逐步降温至-25℃→液氮罐（-196℃）保藏措施：低温、加保护剂（10%甘油）适用：范围广泛保藏期：一般2～3年，长则9年。菌种的衰退、复壮与保藏菌种冻存管菌种的衰退、复壮与保藏7种常用菌种保藏方法的比较方法主要措施适宜菌种保藏期评价斜面低温保藏法低温（4℃）各大类约1～6月简便冰箱保藏法（半固体）低温（4℃），避氧细菌，酵母菌约6