《中华蜜蜂囊状幼虫病毒检测 等温扩增-CRISPR cas13a法（征求意见稿）》编制说明

T/ASAC012—2025T/ASAC012—20253尚未找到适合中华蜜蜂囊状幼虫病毒（CSBV）株分离培本标准我们开发了一种基于等温扩增-CRISPR/CasCSBV检测方法，这种方法结合重组酶介导的等温核酸扩增技术（RecombAidedAmplification,RAA）和侧向流动试纸条，并且能够灵敏地与低待至少1天的时间得到检测的结果。用户只需要将所检测的试剂加入待测2024年3月召开工作组启动会议，标准工作组提交工作计划2025年1-5月，标准编制组完成《中华蜜蜂囊状幼虫病毒等温扩增-。拟定于2025年1月召开《中华蜜蜂囊状幼虫病毒等温扩增-CRI拟计划于2025年2月，根据审查会意见对标准进行T/ASAC012—202535.1.11干燥后加入20μLDEPC水，置于表B.1反转录体系组分加入量(μL）RNA模板5Oligod(T)23VN210mMdNTPs1ABScriptⅡReactionMix(2×)10ABScriptⅡEnzymeMix(10×)2总体积20表B.2反转录条件温度时间，min25℃542℃6051CSBVEEnzymeMixD-802CSBVEnzymeMixA48管-203CSBVBufferMixA-204MgOAc-205CSBVBufferMixL-206CSBVPositiveControl25uL-207CSBVNegativeControl25uL-208Nuclease-FreeWater-209LateralFlowDipstick48条T/ASAC012—20253向每管CSBVEnzymeMixA中加入42.5uL上述混合液后向相应管中加入5uL60分钟。扩增完成后，向每管CSBVEnzymeMixD中加入2uL扩增产物并置于带有96孔模块的金属浴锅或PCR扩增仪上，T/ASAC012—20255T/ASAC2024—012出现C线和T线或者单独出现T线表明CSBV阳性C：质控带；T：检测带出现C线并且未出现T线表明CSBV阴性C：质控带；T：检测带C线和T线均未出现表明测试无效C：质控带；T：检测带图1试纸条条带T/ASAC012—20255本标准制定的原则严格遵循国家有关产业政策，T/ASAC012—20255（规范性目录）附录A给出了中华蜜蜂囊状幼虫病毒等温扩增-CRISPRcas13a-侧向层析检测试纸条的制备标准。反应。检测实验以等温扩增CSBV核酸产物为模板，利用Cas13a核酸酶和制备金胶体加入金标垫，检测带（T线）上包被抗FAM抗体，当阳性样品中Cas13a会与抗生物素抗体结合，形成C线。样本垫用于吸收并引导样本液体通过试纸表1等温扩增RAA引物序列序列(5,-3,)Primer1CSBV-F1CSBV-R1GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGGGTTTCAAGCAGCCTTATCTCGACCGCACATCTTTATACGACATTCCCGCAAATTCAGCACPrimer2CSBV-F2CSBV-R2GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTTTCAAGCAGCCTTATCTCGACCGCACATTGGCCGTATAAACATATCATTCGCTCCTCCCPrimer3CSBV-F3CSBV-R3GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGGGATTTGGCAATAGCATCCTCTGAACCACATTAGCCACAAACTTCATTTCTAACTCGTAT/ASAC012—20255表2crRNA引物序列Table4-2OligonucleotidePrimerSequence序列(5,-3,)CSBV-crRNA1GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACAAACTTCCCGGGTCTTATACCCACCGTTCSBV-crRNA2GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACAAACTTCCCGGGTCTTATACCCACCGTTCSBV-crRNA3GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACTAATATTGTGCCAACAAATCATTCCTTT表3crRNA合成的反应体系NTP缓冲液混合物T/ASAC012—20255（规范性目录）B.1试纸条主要组成成分编号组成成分含量储存温度1CSBVEEnzymeMixD125uL×4管-80℃2CSBVEnzymeMixA48管-20℃3CSBVBufferMixA1000uL-20℃4MgOAc150uL-20℃5CSBVBu