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生化制品检测技术三磷酸腺苷的检测21三磷酸腺苷的工艺路线（三）氧化磷酸化法

1．工艺路线

氧化磷酸化方法制备ATP的工艺流程如下。三磷酸腺苷的工艺路线（三）（1）氧化反应（2）分离纯化（3）精制2．工艺过程三磷酸腺苷的工艺路线（三）（1）氧化反应：在葡萄糖氧化成二氧化碳的过程中，能量释放，使AMP转化成ATP。酵母中的腺苷酸激酶，几乎可以定量地把AMP变成ATP，理论转化率达90%，实际转化率可达85%。反应步骤为：三磷酸腺苷的工艺路线（三）取AMP（含85%以上）50g用2L水溶解，必要时用浓氢氧化钠溶液调至全溶。另取磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）184.8g，磷酸二氢钾57.5g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）17.5g，溶于5L自来水。两液混合后，投入离心甩干的新鲜酵母1.8～2kg及葡萄糖175g，在30～32℃下缓慢搅拌，发酵起泡。每30min抽样l次，用电泳法（或测无机磷法）观察转化情况，约2h，部分AMP转化成ADP或ATP时，提高温度至37℃，至AMP斑点消失为止，全程4～6h。然后将反应液冷至15℃左右，加入40%三氯醋酸500mL，用盐酸调pH至2，尼龙布过滤，去酵母菌体和沉淀物，留上清液。（2）分离纯化：在上清液中加入颗粒活性炭，于pH2下缓慢搅动2h，吸附ATP。倾去清液后，用pH2的水洗涤活性炭，洗去酵母残余后装柱。再用pH2的水洗至澄清，用氨水:水:95%乙醇＝4:6:100的混合液洗脱ATP，流速30mL/min。将洗脱液置于冰浴中，用盐酸调pH至3.8，加3～4倍量95%乙醇，在5～10℃静置6～8h，倾去清液，沉淀即为去氨后的ATP粗品。将粗品溶于1.5L蒸馏水中，加硅藻土50g，搅拌15min，布氏漏斗过滤，取清液。清液调pH至3，上717阴离子交换树脂柱（100g树脂可吸附10～20gATP），饱和后用pH3、0.03mol/L氯化钠液洗柱，去ADP（回收）和杂质。再用pH3.8、1mol/L氯化钠液洗脱。（3）精制：洗脱液加硅藻土25g，搅拌15min，抽滤，清液pH调至3.5，加3～4倍量95%乙醇，置冰箱过夜。次日滤晶、洗涤、干燥（同前）。按AMP重量计算得率100%～120%，含量80%左右。三磷酸腺苷的工艺路线（三）演示完毕，感谢聆

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