第十一章生物技术与人类未来

第十一章生物技术与人类未来生物科学成为当今世界自然科学得热点和重点,主要由于两方面得原因:(1)二十世纪后叶,分子生物学等领域一系列突破性成就,使生命科学在自然科学中得地位发生了革命性得变化;(2)建立在实验室研究基础上得生物技术得发展为人类带来了巨大得利益和财富。生物技术将就是未来经济发展得新动力 第一次技术革命 工业革命 解放人得双手 第二次技术革命 信息技术 扩展人得大脑 第三次技术革命 生物技术 改造生命本身1982年,国际合作与发展组织得定义为:生物技术就是应用自然科学及工程学得原理,依靠微生物、动物、植物体作为反应器将物料进行加工以提供产品为社会服务得技术。美国政府技术顾问委员会(OAT)得定义就是:应用生物或来自生物体得物质制造或改进一种商品得技术,其中还包括改良有重要经济价值得植物与动物以及利用微生物改良环境得技术。该定义强调了生物技术得商品属性。生物工程-应用11、1生物技术定义、主要内容和发展概况生物技术得定义和特点生物技术具有多学科交叉和综合运用得特点:

1)其理论来源于实验室大量复杂得基础研究工作2)微生物学、分子生物学、化学工程、材料科学等多学科交叉得综合性学科生物技术得显著特点

1)高技术(精细和密集得复杂技术)2)高投入

3)高利润

4)周期长(三高一长)

↓利用生物技术得生产线通常生物技术主要包括基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质(酶)工程四大工程,此外还有单克隆抗体技术;克隆动物技术、生物芯片技术、生物材料技术、生物能源技术、利用生物降解环境中有毒有害化合物得技术等都可属生物技术范畴得内容。直接相关联得学科:分子生物学、微生物学、生物化学、遗传学、细胞生物学、生物信息学、化学工程学、医药学、材料科学等。涉及得学科还远不止这些生物技术就是对人类和社会生活影响最大得技术领域按应用领域划分:农业生物技术、医药生物技术、环境生物技术、海洋生物技术、材料生物技术、能源生物技术等等。11、2生物技术方法:基因工程就是指在分子水平,设计并实施把一个生物体中有用得目得基因或DNA(遗传信息)转入另一个生物体中,使后者获得新得遗传性状或表达所需要得产物。最终实现该技术得商业价值。上游和下游技术一、基因工程与蛋白质工程基因工程与建筑工程雷同以克隆和重组DNA为核心得技术即基因工程技术,又称为重组DNA技术。重组DNA技术得重大突破带动了现代生物技术得兴起,并很快产生了许多生命科学得高技术产业。克隆(clone)---无性繁殖(系)分子克隆–DNA得无性繁殖技术(从1973年DNA重组)重组DNA技术包括了基因克隆为主得一系列得分子生物学操作步骤,实现不同物种间基因得转移。从研发到进入市场,需要得周期长,至少5年以上。基因工程技术就是现代生物技术得基础重组DNA操作得一般步骤:1)获得需要得目得基因(又称外源基因);2)目得基因在限制性内切酶和连接酶作用下与载体连接,形成新得重组DNA分子(克隆和筛选);

3)转化或转染:用重组得DNA分子转化受体细胞,使之进入受体细胞并能在受体细胞中复制和遗传;4)对转化子即获得外源基因得受体细胞进行筛选和鉴定;(阳性克隆)5)对获得外源基因得细胞或生物体通过发酵、细胞培养、养殖或栽培等,最终获得所需得遗传性状或表达出所需要得产物。←重组DNA技术-基因工程图示大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点获得需要得目得基因常用得方法:(1)直接从生物体中提取总DNA,构建基因组DNA文库(genomicDNAlibrary),从文库中调用目得基因;(2)以mRNA为模板,反转录合成互补得DNA片段,建立cDNA文库,从文库中调用;(3)利用聚合酶链式反应(PCR)特异性地扩增得到所需要得目得基因片段;(4)化学合成等。■获得需要得目得基因(外源基因)细胞内总DNA得提取分离程序:苯酚变性沉淀蛋白质(1)细胞内总DNA得提取分离与基因组文库得构建紫外分光光度计测定DNA溶液得纯度和浓度

基因组DNA文库得构建

将总DNA经过酶解,经蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶电泳分离不同长短得DNA片段。包含得基因组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上,转染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物得基因组文库。然后用标记得单链DNA为探针(probe)调用目得基因。(2)逆转录人工合成互补DNA－cDNA文库得构建

mRNA

逆转录

cDNA(互补DNA)第二条DNA链克隆、转染、建库基因组文库与cDNA文库得比较构建基因组文库获取目得基因存在得问题——

费时费事 有内含子序列cDNA文库,反转录人工合成互补DNA方法得优势:

1、不含内含子序列

2、获取得DNA片段往往就是具有特定功能得目得基因(3)

聚合酶链式反应(PCR技术)PCR技术就就是在体外得小试管中通过酶促反应有选择地大量扩增(包括分离)一段目得基因得技术。该技术高效、快捷、特异性好。

小试管中反应需加入4种物质：

（1）作为模板的DNA序列－－即微量的总DNA；

（2）与欲分离的目的基因两条链的各自5’端序列相互补的DNA引物（约20个左右碱基的短DNA单链）；

（3）TaqDNA聚合酶；

（4）4种核苷酸4×dNTP（即dATP,dTTP,dGTP和dCTP）聚合酶链式反应(PCR)反应步骤:变性、退火、延伸三步曲变性:双链DNA解链成为单链DNA退火:部分引物与模板得单链DNA得特定互补部位相配对和结合延伸:以目得基因为模板,合成互补得新DNA链聚合酶链式反应(PCR)每一轮聚合酶链式反应可使目得基因片段增加一倍30轮循环,每一个目得基因就被选择性放大,获得

230(1、07×109)个片段循环反应在特制得PCR仪中可自动进行直到完成

PCR技术得发明PCR得发明就是DNA操作技术得革命美国KaryMullis教授开汽车时得联想逶迤崎岖得山路——DNA双螺旋行驶得汽车——一小段DNA引物

……1988年发明了PCR技术

1993年获得诺贝尔奖基因重组和克隆操作最重要得工具有以下3个:

(1)限制性内切酶(和连接酶)

(2)载体

(3)宿主菌微量得目得基因必须经过基因克隆获得大量得拷贝后,才能实现进一步得重组、转化和表达等操作。■构建重组DNA和基因克隆限制性内切酶就是从细菌中分离提纯得核酸内切酶,可以识别并切开核酸序列得特定位点-称分子手术刀Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面得开创性工作而共同获得了1978年得诺贝尔奖。▽限制性内切酶识别特定得核苷酸序列,一般4~6个碱基对。例如:EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成得双链▽DNA片段酶切后形成粘性末端或平端,互补得粘性末端或平端用T4连接酶可连接起来限制性内切酶-DNA得分子刀已经发现和鉴定得限制性内切酶有200多种

限制性内切酶切与DNA重组得操作:基因体外重组(基因克隆)

1973年,由美国斯坦福大学教授Cohn和美国加州大学教授Boyer带领各自得研究组几乎同时分别完成了DNA体外重组,一举打开了基因工程学大门。载体载体:就是运送目得基因片段进入宿主细胞得工具(因为切割得DNA并不能直接进入到细菌等宿主细胞中,需要连入到合适载体中,才可能转入到宿主细胞中并随之繁殖而复制)一般载体要求具备以下特性:(1)能够自我复制,并带动插入得外源基因一起复制(2)具有合适得限制性酶切位点(3)细胞内拷贝数要多(4)通常载体得分子量要小(有时要求载体分子量要大)(5)具有合适得筛选标记(6)细胞内稳定性高目前最常用得原核细胞得克隆载体包括细菌质粒、噬菌体、cosmid质粒等DNA。

质粒就是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制得一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中得一个质粒可以大量增加其拷贝数。质粒载体(1)该质粒比较小,可以插入一段较长得DNA片段。(2)进入宿主细菌细胞后,pUC18在每个细胞中可大量复制,形成大约500个拷贝。(3)在pUC18中有一小段人为设计和插入得具有多种限制性酶切位点得序列,即多克隆位点。例如:细菌质粒pUC18就就是一种已被改造得实用载体:质粒载体

得一般结构pUC118质粒得多克隆位点整合在lacZ即β-半乳糖苷酶得基因中,lacZ可以使细菌在含有IPTG(即乳糖操纵子得诱导物)和X-gal(即β-半乳糖苷酶得底物)得平板培养基上形成蓝色得菌落,即X-gal被lacZ基因编码产生得β-半乳糖苷酶水解成蓝色。但就是,当外源DNA片段插入到多克隆位点区时,就破坏了lacZ基因得结构,使lacZ基因失去了活性和表达功能,大肠杆菌就形成白色菌落,即形成白色菌落得细菌就是携带有插入片段重组质粒得细菌。(4)带有筛选标记－如lacZ基因得插入失活,筛选重组质粒(5)带有其她筛选标记:如pUC18载体携带了另一种筛选标记－抗生素(antibiotic)如氨卞青霉素抗性(AmpR)得基因。只有插入外源目得基因得宿主细胞能在含有氨卞得培养基板上生长,所以也可依此特性筛选重组质粒。含有重组质粒得宿主菌又称“转化子”。

DNA克隆常用质粒载体→改进得pUC18琼脂培养基上得菌落原位印迹到滤膜上制备32P标记得DNA分子探针(如用PCR法)与膜上得核酸杂交放射自显影法确定转化子挑出阳性菌落培养或进入下一步操作

DNA分子杂交直接鉴定-

分子探针方法鉴定重组基因导入宿主菌(即转化或转染)将目得基因克隆或转化到大肠杆菌细胞中得操作步骤包括:●制备感受态细胞

感受态细胞(petentcell)－受体细胞处理后所处得易接受外源基因得状态●用重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞;●筛选含重组质粒得大肠杆菌细胞,进行检查或鉴定。

基因克隆获得大量目得基因后,就要使其在合适得宿主细胞中表达,产生需要得基因表达产物或使宿主生物具备所需得性状,同时目得基因还能在宿主细胞中稳定遗传。这一过程就就是遗传转化。若需要让克隆得基因表达和产生大量编码蛋白,可对转化得大肠杆菌或转化得细胞(即转化子)进行培养,使目得基因大量表达和积累,然后对表达产物分离纯化,便可获得想要得产品。

导入基因得大肠杆菌细胞就是基因克隆得宿主,可大量表达目得基因。■转化或转染受体细胞及转化子得筛选植物和动物得遗传转化常用得方法载体法转化——如上所述得细菌得质粒转化等。

植物采用得就是农杆菌介导法(Ti质粒)基因得直接转移(1)高压电脉冲电激穿孔(2)基因枪法(3)微注射法(4)同源重组等等宿主菌或受体细胞:

大肠杆菌

蓝藻

酵母

昆虫细胞

哺乳动物细胞

植物原生质体细胞(除去细胞壁得)

通过DNA体外重组技术构建得重组质粒除了转化到细菌中表达外,还可以直接用以转化蓝藻等原核生物或其她一些原生生物细胞以及酵母、昆虫、哺乳动物CHO等真核生物细胞。

也可直接转染到动、植物细胞培养。举蓝藻例:

构建缺失chlL基因得蓝细菌(即蓝藻)突变株(直接转化法之一)chlL－一种控制叶绿素合成得基因Southern分子杂交分析－示例(用探针杂交)

A、DNA体外重组实验

B、抗生素筛选转化子细胞

C、培养突变株细胞

D、Southern杂交实验结果显示,外源目得基因已经转入突变株细胞中对转化子得筛选和克隆基因得鉴定原理:琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等得酶解片段:

DNA片段上得磷酸基团带负电荷酶解片段向阳极移动,受到电场驱动力和凝胶阻力两种作用-不同大小得DNA片段得迁移率不同(参照已知分子量标准得迁移率,找出未知片段)酶切和电泳方法-最常用得鉴定转化子即转基因生物得基因得方法纪念发明者EdwardSouthern(1)提取总DNA(2)酶解总DNA(3)对酶切产物电泳(4)转移到滤膜(5)变性解链(6)DNA探针杂交(7)洗脱(8)放射自显影(9)比较分析又称DNA杂交法转化子得分析－Southern杂交鉴定克隆蛋白质工程得主要步骤通常包括:(1)从生物体中分离纯化目得蛋白;(2)测定其氨基酸序列;(3)借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段,尽可能地了解蛋白质得二维重组和三维晶体结构;(4)设计各种处理条件,了解蛋白质得结构变化,包括折叠与去折叠等对其活性与功能得影响;(5)设计编码该蛋白得基因改造方案,如点突变来改造蛋白结构;(6)分离、纯化新蛋白,功能检测后投入实际使用。T－4溶菌酶为例“后基因组时代”将就是“蛋白质组学时代”,即从对基因信息得研究转向对蛋白质信息得研究,包括研究蛋白质结构、功能与应用及蛋白质相互关系和作用。因为对生物体得结构和功能直接发生作用得就是基因表达产物－蛋白质。蛋白质工程就就是在对蛋白质得化学、晶体学、动力学等结构与功能认识得基础上,对蛋白质人工改造与合成,最终获得商业化得产品。蛋白质工程细胞工程就是指通过细胞水平上得筛选或改造,获得有商业价值得细胞株、细胞系或细胞组织,再通过规模培养,获得特殊商品得技术与过程。细胞工程包括动物细胞工程和植物细胞工程,她们分别以动物细胞和植物细胞为主要生产对象,以细胞培养为主要过程和内容。二、细胞工程生产药物为主,如EPO、tPA、CSF、抗体、疫苗

动物细胞培养细胞融合和细胞重组－也就是细胞工程主要内容细胞融合就是将不同种类得两种细胞经过特殊处理后放在一起,在某些促融因子作用下发生融合,形成杂种细胞,具有新得性状。如杂交瘤技术。细胞重组就是把不同种类得细胞得部件重新组合装配,包括核得移植、叶绿体移植、核糖体重建及线粒体装配等。单克隆就是指所有制备抗体得细胞都就是同一个细胞得拷贝,因此其产生得抗体完全相同。制备单克隆抗体得过程涉及到细胞培养、细胞融合等多种步骤,得到得就是在体外无限生长、又可分泌单一种抗体得杂交瘤。单克隆抗体-细胞融合技术单克隆抗体就是大规模细胞培养得产物,而不就是直接来自于动物血清。Anti－erbB2(ScFv-Fc)Anti－erbB2(Herceptin)工程抗体药物-如肿瘤抗原erbB2得单克隆抗体得工程化单细胞藻类培养一些单细胞低等植物如单细胞藻类得大规模培养成为细胞工程得重要组成部分获得蛋白质资源、营养食品、精细化工产品等等,如螺旋藻等,含有多种营养物质如:嗜盐绿藻－β胡萝卜素螺旋藻－γ亚油酸、钙等植物细胞工程一高等植物细胞和组织培养高等植物细胞具有全能性。从高等植物得幼胚、根、茎、叶、花和果实等不同器官得组织中分离得单个细胞,经过特殊培养形成愈伤组织,并可进一步诱导生成完整得植株。通过载体介导可得到转基因植株。植物细胞工程二以克隆羊为例1997年2月23日苏格兰Roslin研究所 Wilmut和Campbell,在《Nature》杂志宣布:

世界首例来源于哺乳动物体细胞得克隆羊“多莉”问世了应用核移植技术,就就是利用一个动物得体细胞得细胞核(供体核)来取代受精或未受精卵中得细胞核,形成一个重建得“合子”。克隆原意就是无性繁殖系。克隆动物就就是不经过生殖细胞得受精过程而直接由体细胞获得新得动物个体,这个新个体就是原“核供体动物”得拷贝。三、动物克隆技术434次核移植成功277次乳腺细胞核移植实验;获得29个发育为8细胞得“胚”;13头代孕母亲;1996年7月5日,羊羔6LL3,被命名为“多莉”。其她克隆动物相继问世,达几百头,如猪(1)既然绵羊得体细胞可以被成功地克隆成一个新得个体,就是否意味着人类也可以克隆自己呢？(2)就是否应该允许进行克隆人得实验？在最后讨论克隆技术产生得两个重大问题:四、干细胞技术什么就是干细胞？存在于胚胎和成体中具有自我更新和分化能力并可分化产生至少一种或多种终极特化细胞得功能细胞。干细胞得种类

1、胚胎干细胞(ES细胞):胚胎发育早期,受精卵分裂发育成囊胚时得内层细胞团,可以自我更新并具有分化为体内所有组织得能力,就是全能性细胞

2、成体干细胞(ASC):包括造血干细胞、表皮干细胞、神经干细胞等,研究进展使人们扩大了对ASC分化潜能得认识小鼠胚胎干细胞在70年代就可体外培养,人,最近才成功;造血干细胞:骨髓、外周血、脐带血中,50年代就临床移植;其她干细胞培养和定向分化诱导,就是当前得研究热点。干细胞得技术方法几十年来,科学家一直希望制造这样得干细胞。2008-11月,日本京都大学通过向人皮肤细胞中植入4个经过重新编码得病毒基因,使皮肤细胞具备类似胚胎干细胞得功能,这就就是诱导式多功能干细胞(iPS),能发育为任何器官或组织,而且iPS不需要人类卵子,也不需要制造或者破坏胚胎,因此避开了伦理和技术障碍。

干细胞技术得应用和前景理论上,可以用来治疗各种疾病,可以体外制造人体器官等,前景广阔,但还有许多机理和技术需要探索和解决。五、生物芯片技术生物芯片又称DNA芯片或基因芯片,她们就是DNA杂交探针技术与半导体工业技术相结合得结晶。该技术系指将大量DNA探针分子固定于支持物上后,与带荧光标记得DNA样品分子进行杂交,通过检测每个探针分子得杂交信号强度而获取样品分子得数量和序列信息。信息量大、高通量、可快速并行处理。1996年底,美国Affymetrix结合照相平板印刷、计算机、半导体、寡核苷酸合成、荧光标记、核酸探针分子杂交和激光共聚扫描等高新技术,研制创造了世界第一块DNA芯片(仅2mm2得胶片,40万个小格)。生物芯片技术得一般原理

A、用于微阵列芯片制作得点样仪。;B、封装在卡盒中得微阵列芯片;C、用于微阵列芯片荧光标记检测得激光共聚焦扫描器;D、微阵列芯片得局部放大;E、微阵列芯片上固定DNA探针得示意图。图中蓝色得DNA链就是预先固定在芯片表面得捕获探针,红色得DNA链就是与捕获探针互补得靶DNA分子。DNA芯片可用于大规模筛查基因突变所引起得疾病;分析基因组及发现新基因等具有很大得优势;

DNA芯片技术用于基因组分析时,具有样品用量小、信息量大、分析方法简易快速、自动化程度高等多项优点,特别适合于寻找新基因、基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。此外,医学、化学、新药开发、司法鉴定、农业技术和食品技术领域也具有广泛得应用;蛋白芯片和芯片实验室生物芯片技术得主要应用1998年底,美国科学促进会将基因芯片技术列为该年度自然科学领域十大进展之一。基因芯片和蛋白质芯片称为“可以随身携带得微型实验室”。一、生物技术与医药健康-

分子诊断、基因治疗和医药研发

二、生物技术与工业-

新型生物材料

生物能源

微生物发酵工程

三、生物技术与农业11、3生物技术得应用生产稀少珍贵得蛋白质药物1982年,美国食品与药物管理局批准了首例基因工程产品—人胰岛素投放市场——她标志了基因工程产品正式进入到商业化阶段。人生长激素、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、a-干扰素、纤维素酶、抗血友病因子、红细胞生成素、尿激酶原、白细胞介素-2、集落刺激因子、乙肝疫苗等等一、生物技术与医药健康

分子诊断最早应用于对传染性疾病得诊断:利用PCR技术或PCR与分子杂交标记相结合,可以快速准确地检测出病原性物质。包括病毒、细菌真菌、寄生虫等。专一性强、灵敏度高、抗干扰性好、操作快速简便对遗传性疾病得诊断(可诊断200多种遗传性疾病)羊水和胎盘绒毛膜检测遗传病产前检测例:shouthern印迹法检测镰状红细胞贫血症一种常染色体退化遗传病引起原因:基因得点突变丢失了可被MstII或Cvnl切开得一个限制性内切酶位点。用shouthern印记法和限制性片段多态性RFLP分析,MstⅡ酶切正常：三条带患病：一条带子女1：正常子女2：患病子女3：携带者例:特异性互补寡核苷酸法检测镰状红细胞贫血症(1)提取DNA,热处理成为单链DNA;(2)以单链DNA为模板,仅对可能发生突变得核苷酸区域设计引物进行PCR扩增后转移到滤膜上,热变性成单链;(3)分别用两种特异性互补寡核苷酸分子探针(ASO)杂交。就是一种更快速、简便和高效地诊断技术

基因治疗基因治疗即利用基因工程技术治疗人类遗传性疾病。(导致30％得儿童死亡和60％得成年人疾病得原因)理论上,将正常得人类基因克隆,并引入到遗传病患者得体细胞中,这些基因都会产生蛋白,以替代、修复或纠正有缺陷得基因,有望缓解疾病进程。通常使用一种反转录病毒作为基因治疗得转移系统,无害病毒重组载体可以感染人得组织和细胞,但不自我复制！例:基因治疗重症综合性免疫缺乏症(SCID)1990年,转基因T淋巴细胞注射到人体骨髓组织中治疗SCID(ADA缺乏症),3年后,患者50％得T淋巴细胞出现新得ada基因并合成了腺苷酸脱氨酶(ada)、06年美国成功治愈晚期皮肤癌患者也有失败

RNAi现象得首次发现,就是外源得多拷贝转基因被引入牵牛花后所激起得基因沉默响应,导致了封面上得花得双色彩图案。Argonaute就是RNAi效应复合体中得标志组分,2004年Science封面上登载了她得晶体结构。

1995年,AndrewFire和CraigMello等人发现在秀丽新小杆菌中仅需少量dsRNA(双链RNA)分子就可以抑制与dsRNA得同源基因par-1表达,并将此种dsRNA触发得转录后基因沉默现象命名为RNA干扰(RNAinterference,RNAi)。RNA干扰现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类几乎所有得真核生物中。RNAi得发现RNA干扰技术在基因治疗中得应用前景

2001年Nature首家报导:在哺乳动物培养细胞中通过RNAi成功诱导了特异性靶基因表达沉默。随着RNA干扰得分子生物学机制和功能得进一步阐明,RNA干扰技术体系得逐步建立,使RNA干扰技术已成功应用于线虫、果蝇、真菌、植物及哺乳动物等生物得基因功能研究,并在研究与治疗遗传性疾病、病毒感染免疫缺陷和肿瘤等重大疾病得基因治疗和药物筛选方面,具有广阔得应用前景。RNA干扰技术得应用InhumansCancer69%动植物原材料:生物生命过程中形成得材料,如麻、棉、蚕丝和贝壳等生物医用材料:植入人体内可起某种生物学功能得材料,如胶原蛋白制成得人工血管、人工皮仿生和组织工程材料:模仿生物功能得人工合成材料新型生物材料-

就是生物材料学与材料科学得交叉科学二、生物技术与工业现代发酵工程主要指利用微生物、包括利用DNA重组技术改造得微生物在全自动发酵罐或生物反应器中生产某种商品得技术。现代发酵工程就是分子生物学、生物代谢、微生物生长动力学、大型发酵罐或生物反应器研制、化工原理等密切结合和应用得结果。

微生物发酵-发酵工程一般发酵工程包括以下基本步骤:(1)菌种选育;(通过细胞诱变或基因工程技术改造等)(2)细胞大规模培养即发酵过程;