MicroRNA-21对中耳胆脂瘤细胞增殖和凋亡调控作用的深度剖析

MicroRNA-21对中耳胆脂瘤细胞增殖和凋亡调控作用的深度剖析一、引言1.1中耳胆脂瘤研究背景中耳胆脂瘤是一种并非真正肿瘤的囊性结构，却有着类似肿瘤的特性，它以中耳腔内高度增殖的角化鳞状上皮积存以及临近骨质遭到破坏为主要特征。从发病机制角度划分，其类型包含先天性胆脂瘤、后天原发性胆脂瘤和后天继发性胆脂瘤。先天性胆脂瘤患者早期因鼓膜正常难以察觉，多在听力下降就医时，通过检查发现鼓膜后白色团块影得以确诊。后天原发性胆脂瘤最为常见，患者儿童时期常存在咽鼓管长期阻塞病史，由于中耳上鼓室负压致使鼓膜松弛部袋状内陷，脱落上皮在囊袋内聚集形成胆脂瘤，临床表现多样，部分有耳流脓、听力下降症状，部分无症状。后天继发性胆脂瘤常见于鼓膜边缘性穿孔患者，外耳道上皮沿穿孔缘长入鼓室引发，患者症状出现早，主要表现为耳流脓和听力下降，耳部外伤及手术也可能引发。中耳胆脂瘤虽为良性病变，却具有如侵袭性、迁移性、破坏性、复发性、高度增殖和分化变异性等恶性肿瘤样生物学行为。其所引发的骨质破坏会造成一系列严重后果，如导致听力下降，影响患者日常生活与社交沟通；引发内耳功能紊乱，使患者出现眩晕、耳鸣等不适症状，降低生活质量；造成面神经麻痹，导致面部表情异常，影响患者外貌与心理健康；甚至可能引发颅内并发症，如脑膜炎、脑脓肿等，严重威胁患者生命健康。临床中观察到，儿童胆脂瘤相较成人更具侵袭性和危险性，其生长速度快，易于扩散，病变范围广泛，术后复发率也明显高于成人。当前，针对中耳胆脂瘤主要的治疗手段是手术切除。然而，手术治疗存在明显弊端，术后容易出现复发或残留情况，这就使得患者常常需要多次接受手术。多次手术不仅会给患者带来身体上的痛苦和经济上的负担，还会显著增加并发症发生的概率，严重影响患者的听功能，导致患者听力进一步下降甚至丧失，极大地降低患者的生活质量。尽管医学领域对中耳胆脂瘤的关注和研究持续增加，但截至目前，胆脂瘤发生的确切机制仍旧不明确。近年来，国内外学者积极从组织酶学、癌基因、细胞因子、生长因子及其受体等多个方面深入探究胆脂瘤发生的分子机制。研究结果显示，在中耳胆脂瘤组织中，许多生长因子和信号分子基因的表达呈现上调趋势，同时，与细胞增殖、分化、凋亡及骨质破坏相关的蛋白质表达也显著增强。虽然关于胆脂瘤细胞凋亡能力的研究结论存在分歧，但大量研究确凿证实，与正常皮肤相比，胆脂瘤上皮具备类似肿瘤细胞一样高度增殖的能力。对中耳胆脂瘤发病机制的深入研究迫在眉睫，只有明确其发病机制，才能够为开发更加有效的治疗方法提供坚实的理论基础，从而提高治疗效果，降低复发率，减少并发症的发生，改善患者的预后和生活质量。1.2MicroRNA-21概述MicroRNA-21（miR-21）是一类长度约22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，在生物体内发挥着至关重要的调控作用。其编码基因定位于17q23.2，位于跨膜蛋白49（TMEM49）基因的内含子区域内，但可通过自身独特的启动子区域独立完成转录过程，经过一系列复杂的加工，最终形成具有生物活性的成熟miR-21。miR-21在多种组织和细胞中广泛表达，参与细胞的增殖、分化、凋亡、迁移等诸多基本生物学过程。它主要通过与靶基因mRNA的3'-非翻译区（3'-UTR）完全或不完全互补配对，从而对靶基因的表达进行负向调控。当miR-21与靶mRNA完全互补配对时，可触发mRNA的降解过程，使其无法进一步翻译为蛋白质；若为不完全互补配对，则会阻碍mRNA的翻译进程，抑制蛋白质的合成，以此精准调控细胞内各种生物学功能的有序进行。大量研究表明，miR-21与多种疾病的发生发展密切相关。在肿瘤领域，miR-21被视为一种关键的致癌基因，在肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌等多种实体肿瘤以及慢性淋巴细胞性白血病、B细胞性淋巴瘤等非实体瘤中均呈现高表达状态。它通过调控一系列与肿瘤相关的靶基因，如磷酸酶张力蛋白同源物（PTEN）、程序性细胞凋亡因子4（PDCD4）等，参与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移以及抗药性的形成过程。以PTEN为例，PTEN是一种重要的抑癌基因，能够负向调控磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路，抑制细胞的增殖和存活。而miR-21可通过与PTENmRNA的3'-UTR结合，抑制PTEN的表达，进而激活PI3K/Akt信号通路，促进肿瘤细胞的增殖和存活，增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力。在心血管疾病方面，如动脉粥样硬化、肺动脉高压、心衰、心肌缺血等，miR-21的表达水平也会发生显著变化，并在疾病的发生发展进程中发挥重要作用。在动脉粥样硬化的形成过程中，miR-21参与调控血管内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞的功能，影响炎症反应、脂质代谢和细胞凋亡等关键环节。鉴于miR-21在疾病调控中的重要作用，探究其在中耳胆脂瘤中的作用机制意义重大。中耳胆脂瘤虽为良性病变却有恶性肿瘤样行为，当前发病机制不明且手术治疗弊端多。若能明确miR-21在其中的作用，或可为揭示中耳胆脂瘤发病机制带来突破，为开发新治疗方法奠定基础，提供新思路和潜在靶点，助力改善患者预后和生活质量。1.3研究目的与意义本研究旨在深入探究MicroRNA-21（miR-21）对中耳胆脂瘤细胞增殖和凋亡的调控作用，明确miR-21及其相关靶基因在中耳胆脂瘤发病过程中的分子机制。通过一系列实验，包括检测miR-21及其靶基因在中耳胆脂瘤组织中的表达情况，构建体外细胞模型研究miR-21对中耳胆脂瘤角质细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响，为揭示中耳胆脂瘤的发病机制提供新的理论依据。中耳胆脂瘤虽为良性病变，却因其类似肿瘤的生物学行为，如侵袭性、迁移性、破坏性、复发性、高度增殖和分化变异性，给患者带来极大危害。其引发的骨质破坏可导致听力下降、内耳功能紊乱、面神经麻痹，甚至颅内并发症，严重威胁患者的生活质量与生命健康。儿童胆脂瘤相较于成人，侵袭性和危险性更高，生长速度快、易于扩散、病变范围广且术后复发率高。目前手术切除是主要治疗手段，但术后易复发或残留，患者常需多次手术，不仅承受身体痛苦和经济负担，还面临并发症发生和听功能障碍加剧的风险。在发病机制尚未明确的情况下，深入研究miR-21对中耳胆脂瘤细胞的调控作用意义重大。从理论层面来看，miR-21作为一种广泛存在且在多种生理病理过程中发挥关键调控作用的非编码小分子RNA，参与细胞的增殖、分化、凋亡、迁移等基本生物学过程。探究其在中耳胆脂瘤中的作用机制，有助于进一步揭示中耳胆脂瘤发病的分子生物学基础，丰富对该疾病发病机制的认识，为后续深入研究提供方向和思路，完善中耳胆脂瘤的理论研究体系。从临床应用角度出发，若能明确miR-21在中耳胆脂瘤中的作用，将为开发新的治疗方法奠定坚实基础。一方面，miR-21有可能成为中耳胆脂瘤诊断和病情评估的新型生物标志物，通过检测其表达水平，实现对疾病的早期诊断、病情监测以及预后判断，提高诊断的准确性和及时性；另一方面，以miR-21及其相关靶基因作为治疗靶点，开展基于基因治疗的新策略，或与传统治疗方法联合应用，有望提高治疗效果，降低复发率，减少并发症的发生，改善患者的预后和生活质量，为中耳胆脂瘤患者带来新的治疗希望。二、中耳胆脂瘤与细胞增殖、凋亡2.1中耳胆脂瘤的发病机制2.1.1现有发病机制假说中耳胆脂瘤发病机制复杂，虽经多年研究，确切机制仍未完全明确，目前存在多种假说。先天性胚胎上皮残留学说认为，先天性中耳胆脂瘤起源于胚胎期外胚层上皮细胞的残留。在胚胎发育过程中，这些上皮细胞未正常退化或消失，残留于中耳腔，随着时间推移，这些残留的上皮细胞不断增殖、角化，逐渐形成胆脂瘤。临床研究发现，部分先天性中耳胆脂瘤患者在耳部检查时，可发现中耳腔存在与周围组织界限清晰的白色团块状物，病理检查证实为角化鳞状上皮堆积，支持了该假说。袋装内陷学说指出，咽鼓管功能障碍是引发中耳胆脂瘤的关键因素。当咽鼓管通气不畅时，中耳腔长期处于负压状态，这会导致鼓膜松弛部或紧张部后上方向内凹陷，形成内陷囊袋。随着时间的推移，囊袋内不断有角化上皮增生和上皮屑堆积，且排出受阻，致使囊袋逐渐膨胀扩大，周围骨质遭到破坏，最终形成胆脂瘤。临床观察发现，许多中耳胆脂瘤患者都存在咽鼓管功能不良的病史，影像学检查也显示患者中耳腔存在内陷袋结构，且内陷袋与胆脂瘤的形成部位相关，为该学说提供了有力证据。上皮移行学说认为，慢性化脓性中耳炎患者的外耳道和鼓膜上皮，会沿着穿孔的骨面，向鼓膜、鼓室窦、鼓窦、乳突区内移行生长。在移行过程中，上皮细胞不断脱落，其脱落的上皮组织和角化物质大量堆积，聚集成团，进而导致中耳胆脂瘤的形成。对慢性化脓性中耳炎患者进行手术时，常可观察到外耳道上皮向鼓室内生长的现象，且在鼓室内发现大量角化物质堆积，与该学说相符。基底细胞增殖学说主张，鼓膜松弛部位的上皮细胞过度增殖，形成上皮小柱。这些上皮小柱逐渐破坏基底层，进入上皮下组织，在此基础上产生胆脂瘤。通过对中耳胆脂瘤组织进行病理学分析，可发现鼓膜松弛部上皮细胞的增殖活性明显高于其他部位，且存在上皮小柱向深层组织生长的现象，为该学说提供了一定的理论依据。鳞状上皮化生学说认为，中耳黏膜上皮细胞在受到炎症因子等的长期刺激后，可化生为角化性鳞状上皮。这些化生的角化性鳞状上皮不断增殖、脱落，其脱落的角化物质若发生堆积，即可形成胆脂瘤。在一些中耳慢性炎症患者的中耳黏膜中，可检测到化生的角化性鳞状上皮，且随着炎症的加重，胆脂瘤形成的风险增加，支持了这一学说。2.1.2细胞增殖和凋亡在发病中的作用细胞增殖和凋亡在中耳胆脂瘤的发病过程中起着关键作用，其异常与胆脂瘤的形成和发展密切相关。中耳胆脂瘤的显著特征之一是上皮细胞的过度增殖。与正常外耳道皮肤上皮相比，胆脂瘤上皮细胞中细胞增殖标记物，如增殖细胞核抗原（PCNA）、Ki-67等的表达明显升高。PCNA是DNA聚合酶的辅助蛋白，在细胞增殖的DNA合成期大量表达。研究表明，在胆脂瘤上皮组织中，PCNA阳性细胞数量增多，且染色强度增强，主要分布于基底和基底上层细胞，表明这些区域的细胞增殖活跃。Ki-67核抗原表达于细胞周期的所有活性阶段（G1、S、G2、M），而不表达于细胞周期的非活性阶段（G0）。有学者应用免疫组化法对胆脂瘤进行检测，发现Ki-67在胆脂瘤中的表达高于外耳道皮肤和耳后区皮肤，增殖的角质形成细胞数量增多，在基底和基底上层均可检测到。Mahmood等研究发现Ki-67在胆脂瘤组织中过表达，且与骨吸收活性呈正相关，提示Ki-67可以预测胆脂瘤的侵袭性。细胞增殖相关信号通路，如角质细胞生长因子（KGF）/角质细胞生长因子受体（KGFR）信号通路也参与其中。KGF主要由基质中的成纤维细胞分泌，与其受体KGFR结合后，可激活细胞内激酶域，使KGFR磷酸化，进而激活Ras/Raf/MAPK通路和PI3K/Akt通路，导致细胞增殖和存活。Xie等研究发现KGF/KGFR在胆脂瘤中的表达与复发之间存在显著的正相关关系，提示该信号通路可能参与了胆脂瘤上皮细胞高增殖活性和胆脂瘤复发。细胞凋亡异常在中耳胆脂瘤发病中同样不容忽视。关于胆脂瘤上皮细胞凋亡状态的研究存在一定争议，早期一些学者认为胆脂瘤上皮细胞的凋亡显著增加，从而导致中耳腔内大量角化鳞屑的堆积。但近年的研究更倾向于胆脂瘤上皮细胞的凋亡受到抑制。抗凋亡信号通路，如PI3K/Akt/PKB通路在其中发挥重要作用。活化的Akt可使BAD、前caspase-9等促凋亡蛋白失活，是一种重要的抗凋亡调节因子。Zang等研究发现胆脂瘤上皮中活化的Akt表达显著增高。刘东亮等研究表明，与对照组相比，胆脂瘤上皮中10号染色体缺失张力蛋白磷酸酶（PTEN）表达较低，p-Akt表达较高，两者呈明显负相关，使胆脂瘤凋亡受到抑制。凋亡相关基因及调控因子，如Fas（CD95受体）/FasL（CD95配体）、肿瘤坏死因子受体等也参与胆脂瘤细胞的凋亡机制。Park等发现Fas蛋白在胆脂瘤上皮棘层和颗粒层表达增强，认为Fas在中耳胆脂瘤的凋亡调控中起重要作用。研究发现复发性胆脂瘤中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA的水平显著高于初发胆脂瘤，表明胆脂瘤中细胞凋亡增加。肿瘤坏死因子样弱诱导凋亡因子（TWEAK）和TNF-α在胆脂瘤组织中比在外耳道皮肤中表达强，且两者具有相关性，TWEAK通过上调TNF-α诱导细胞死亡。细胞增殖和凋亡的失衡是中耳胆脂瘤形成的重要原因。当细胞增殖超过细胞凋亡时，上皮细胞过度增生，逐渐形成胆脂瘤。这种失衡可能由多种因素导致，如炎症刺激、基因表达异常等。炎症可能通过激活细胞增殖相关信号通路，同时抑制凋亡相关信号通路，从而影响细胞增殖和凋亡的平衡。基因表达异常可导致细胞增殖和凋亡相关蛋白的表达改变，进而引发失衡。对中耳胆脂瘤发病机制中细胞增殖和凋亡作用的深入研究，有助于揭示其发病的分子生物学基础，为开发新的治疗方法提供理论依据。2.2中耳胆脂瘤细胞的增殖与凋亡特点2.2.1细胞增殖特点中耳胆脂瘤细胞呈现出显著的增殖活跃特性。研究表明，与正常外耳道皮肤上皮细胞相比，胆脂瘤上皮细胞中多种细胞增殖标记物的表达明显上调。增殖细胞核抗原（PCNA）作为一种反映细胞增殖状态的重要指标，在胆脂瘤上皮组织中阳性细胞数量显著增多，且染色强度增强，主要集中分布于基底和基底上层细胞，表明这些区域的细胞正处于旺盛的增殖状态。在对50例中耳胆脂瘤患者的研究中，采用免疫组化法检测发现，PCNA在胆脂瘤上皮中的表达水平显著高于正常外耳道皮肤上皮，差异具有统计学意义。Ki-67核抗原同样是细胞增殖的关键标志物，其表达贯穿于细胞周期的G1、S、G2、M等活性阶段。相关研究显示，Ki-67在胆脂瘤中的表达显著高于外耳道皮肤和耳后区皮肤。对40例胆脂瘤标本进行检测，结果显示Ki-67阳性细胞在胆脂瘤上皮的基底和基底上层广泛分布，而在正常皮肤上皮中，Ki-67仅出现在基底层，且阳性细胞数量较少。Mahmood等学者的研究进一步发现，Ki-67在胆脂瘤组织中的表达水平与骨吸收活性呈正相关关系，这意味着Ki-67的高表达不仅反映了细胞的增殖活跃程度，还与胆脂瘤的侵袭性密切相关，可作为预测胆脂瘤侵袭性的重要指标。与肿瘤细胞相比，中耳胆脂瘤细胞的增殖虽然活跃，但并非完全不受控制。肿瘤细胞的增殖往往具有失控性，能够持续无限制地分裂生长，且具有较强的转移能力。而中耳胆脂瘤细胞在众多基因、蛋白和生长因子等的精细调控下，其增殖与细胞凋亡之间存在着相互制约的关系。当细胞增殖过度时，凋亡机制会被激活，以阻止细胞的无限增殖。从染色体水平来看，胆脂瘤细胞无明显的染色体变异，这表明其增殖特性与肿瘤细胞存在本质区别，虽然具有较强的增殖能力，但仍保持着一定的正常细胞生物学特性。细胞角蛋白（CK）家族在胆脂瘤上皮细胞增殖中也发挥重要作用。CK5、CK6是基底细胞增殖的标志，CK13是上皮分化的标志，CK16是上皮增殖的标志。研究发现胆脂瘤上皮有CK16和CK13的表达，而外耳道上皮仅有CK13表达。CK16主要表达于邻近外耳道的胆脂瘤复层上皮、外耳道复层上皮和鼓膜，且在胆脂瘤上皮厚的区域表达明显强于上皮薄的区域。利用三种中耳胆脂瘤动物模型研究发现，作为细胞增殖标志的CK13、CK16在袋状内陷组表达增强，且其表达增强与胆脂瘤的进程相关，说明CK的表达与胆脂瘤上皮的增殖、迁移密切相关。2.2.2细胞凋亡特点中耳胆脂瘤细胞的凋亡呈现出复杂的特点，其凋亡状态的研究存在一定的争议。早期的一些研究观点认为，胆脂瘤上皮细胞的凋亡显著增加，这一观点的依据在于中耳腔内大量角化鳞屑的堆积，推测可能是由于细胞凋亡过度导致的。有学者通过对胆脂瘤组织的观察，发现其中存在较多的凋亡小体，认为这是细胞凋亡增加的证据。然而，近年来越来越多的研究倾向于认为胆脂瘤上皮细胞的凋亡受到抑制。抗凋亡信号通路在胆脂瘤上皮细胞凋亡抑制中发挥着关键作用。以PI3K/Akt/PKB通路为例，活化的Akt能够使BAD、前caspase-9等促凋亡蛋白失活，从而发挥重要的抗凋亡调节作用。Zang等学者的研究发现，在胆脂瘤上皮中，活化的Akt表达显著增高。刘东亮等学者进一步研究表明，与对照组相比，胆脂瘤上皮中10号染色体缺失张力蛋白磷酸酶（PTEN）表达较低，p-Akt表达较高，两者呈明显负相关关系。由于PTEN可使PI3K通路中的PIP3去磷酸化，从而失活Akt和下游效应分子，负性调节PI3K/Akt/PKB信号通路。当PTEN表达降低时，PI3K/Akt/PKB信号通路被激活，导致胆脂瘤上皮细胞凋亡受到抑制。凋亡相关基因及调控因子也参与了胆脂瘤细胞的凋亡机制。Fas（CD95受体）/FasL（CD95配体）系统在细胞凋亡调控中具有重要作用。Park等学者发现，Fas蛋白在胆脂瘤上皮棘层和颗粒层表达增强，认为Fas在中耳胆脂瘤的凋亡调控中起重要作用。肿瘤坏死因子受体相关的凋亡调控也不容忽视。研究发现复发性胆脂瘤中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA的水平显著高于初发胆脂瘤，表明胆脂瘤中细胞凋亡增加。肿瘤坏死因子样弱诱导凋亡因子（TWEAK）和TNF-α在胆脂瘤组织中比在外耳道皮肤中表达更强，且两者具有相关性，TWEAK可通过上调TNF-α诱导细胞死亡。细胞凋亡异常对中耳胆脂瘤疾病进程产生着深远影响。当细胞凋亡受到抑制时，细胞增殖与凋亡的平衡被打破，细胞增殖相对过度，导致胆脂瘤上皮细胞不断增生，胆脂瘤逐渐增大。这不仅会进一步破坏周围骨质，加重听力下降、内耳功能紊乱、面神经麻痹等症状，还会增加颅内并发症的发生风险。而若细胞凋亡过度，可能导致中耳腔内大量角化鳞屑堆积，影响中耳的正常生理功能。因此，维持细胞增殖与凋亡的平衡对于控制中耳胆脂瘤的发展至关重要。三、MicroRNA-21的作用机制3.1MicroRNA-21的生物学特性MicroRNA-21（miR-21）作为内源性非编码小分子RNA，具有独特的生物学特性。其编码基因位于17q23.2，处于跨膜蛋白49（TMEM49）基因的内含子区域，但转录过程独立，依靠自身启动子区域完成。miR-21的生成是一个复杂且精细的过程，涉及多个关键步骤和多种酶的参与。首先，在细胞核内，RNA聚合酶Ⅱ以DNA为模板转录生成初始转录本pri-miR-21，pri-miR-21长度可达数百个核苷酸，具有复杂的二级结构。随后，在核酸酶Drosha和其辅助因子DGCR8组成的微处理器复合体作用下，pri-miR-21被精确剪切成约70-100个核苷酸的发夹状前体pre-miR-21。这一剪切过程高度精准，确保了pre-miR-21的结构和功能完整性。pre-miR-21在转运蛋白Exportin-5和Ran-GTP的协助下，从细胞核转运至细胞质。在细胞质中，Dicer酶进一步对pre-miR-21进行加工，将其剪切成约22个核苷酸的双链miR-21。双链miR-21中的一条链会选择性地整合入RNA诱导沉默复合体（RISC），形成具有活性的RISC-miR-21复合物，进而发挥其对靶基因的调控作用。miR-21在生物体内分布广泛，几乎在所有组织和细胞中均有表达。在正常生理状态下，miR-21参与细胞的多种基本生物学过程，对维持细胞的正常功能和内环境稳定起着重要作用。在细胞增殖过程中，miR-21可通过调控相关靶基因，影响细胞周期进程，促进细胞的增殖。研究发现，在某些正常组织的生长发育过程中，miR-21的表达水平会随着细胞增殖活动的增强而升高。在细胞凋亡方面，miR-21能够通过调节凋亡相关基因的表达，抑制细胞凋亡，维持细胞数量的相对稳定。在胚胎发育过程中，miR-21对于细胞的分化和组织器官的形成也具有重要的调控作用。它可以影响干细胞的分化方向，促进特定细胞类型的生成，确保组织器官的正常发育。miR-21的功能具有多样性，在不同的生理病理条件下，其功能表现有所差异。在肿瘤发生发展过程中，miR-21扮演着致癌基因的角色。在多种实体肿瘤，如肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌等，以及非实体瘤，如慢性淋巴细胞性白血病、B细胞性淋巴瘤等中，miR-21均呈现高表达状态。它通过调控一系列与肿瘤相关的靶基因，如PTEN、PDCD4等，参与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移以及抗药性的形成过程。以PTEN为例，PTEN是一种重要的抑癌基因，能够负向调控PI3K/Akt信号通路，抑制细胞的增殖和存活。而miR-21可通过与PTENmRNA的3'-UTR结合，抑制PTEN的表达，进而激活PI3K/Akt信号通路，促进肿瘤细胞的增殖和存活，增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力。在心血管疾病方面，如动脉粥样硬化、肺动脉高压、心衰、心肌缺血等，miR-21的表达水平也会发生显著变化，并在疾病的发生发展进程中发挥重要作用。在动脉粥样硬化的形成过程中，miR-21参与调控血管内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞的功能，影响炎症反应、脂质代谢和细胞凋亡等关键环节。在炎症反应中，miR-21可调节炎症细胞的活化和炎症因子的释放，参与炎症的发生和发展。3.2MicroRNA-21对基因表达的调控方式MicroRNA-21（miR-21）主要通过与靶mRNA的3'-非翻译区（3'-UTR）相互作用，对基因表达进行精细调控，其调控方式主要有两种：mRNA降解和翻译抑制。当miR-21与靶mRNA的3'-UTR完全互补配对时，会触发mRNA的降解过程。在RNA诱导沉默复合体（RISC）的参与下，miR-21引导RISC识别并结合靶mRNA，随后核酸内切酶对靶mRNA进行切割，使其降解为小分子片段，从而无法进行翻译过程，导致基因表达水平降低。在肿瘤细胞中，miR-21可通过与PTENmRNA的3'-UTR完全互补配对，促使PTENmRNA降解。PTEN作为一种重要的抑癌基因，其表达降低会解除对PI3K/Akt信号通路的抑制，进而激活该信号通路，促进肿瘤细胞的增殖、存活和侵袭。研究表明，在乳腺癌细胞中，过表达miR-21会显著降低PTENmRNA的水平，同时增强PI3K/Akt信号通路的活性，导致细胞增殖能力增强。若miR-21与靶mRNA的3'-UTR不完全互补配对，则会抑制mRNA的翻译进程。此时，miR-21与RISC结合形成复合物，识别并结合靶mRNA，但不会导致mRNA的降解。该复合物通过阻碍核糖体与mRNA的结合，或者阻止核糖体在mRNA上的移动，抑制蛋白质的合成过程，从而在翻译水平上抑制基因表达。miR-21对程序性细胞凋亡因子4（PDCD4）的调控就属于这种方式。PDCD4是一种肿瘤抑制因子，能够抑制肿瘤细胞的增殖和转移。miR-21可通过与PDCD4mRNA的3'-UTR不完全互补配对，抑制PDCD4的翻译，使PDCD4蛋白表达减少。在肺癌细胞中，miR-21的高表达会导致PDCD4蛋白水平降低，进而促进肿瘤细胞的侵袭和转移。除了上述两种经典的调控方式外，近年来的研究还发现miR-21可能存在其他的调控机制。有研究表明，miR-21可能通过影响mRNA的稳定性，间接调控基因表达。miR-21与靶mRNA结合后，可能会招募相关的核酸酶或蛋白质复合物，改变mRNA的结构，使其更容易被降解，从而影响基因表达水平。miR-21还可能参与转录水平的调控。它可以通过与转录因子相互作用，影响转录因子与靶基因启动子区域的结合，从而调控基因的转录过程。但这些调控机制仍处于研究阶段，其具体的作用方式和生物学意义还有待进一步深入探究。3.3MicroRNA-21在其他疾病中的作用研究MicroRNA-21（miR-21）在多种疾病的发生发展过程中扮演着关键角色，对其在不同疾病中的作用研究，为深入理解疾病机制以及开发新的治疗策略提供了重要线索。在肿瘤领域，miR-21被广泛认定为一种致癌基因，在众多实体肿瘤和非实体瘤中均呈现高表达状态。在肺癌中，miR-21的高表达与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移能力密切相关。研究表明，miR-21可通过抑制靶基因PDCD4的表达，促进肺癌细胞的迁移和侵袭。在对100例肺癌患者的组织样本检测中发现，miR-21表达水平高的患者，其肿瘤的恶性程度更高，预后更差。在胃癌中，miR-21同样发挥着促癌作用。它可通过靶向作用于PTEN基因，激活PI3K/Akt信号通路，促进胃癌细胞的增殖和存活。一项临床研究显示，胃癌患者血清中miR-21的表达水平明显高于健康对照组，且其表达水平与肿瘤的分期和淋巴结转移相关。在乳腺癌中，miR-21的高表达与肿瘤的耐药性相关。研究发现，miR-21可通过调控相关靶基因，降低乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性，导致肿瘤细胞对化疗产生耐药。在非实体瘤方面，如慢性淋巴细胞性白血病中，miR-21的高表达可抑制细胞凋亡，促进肿瘤细胞的增殖和存活。心血管疾病方面，miR-21在动脉粥样硬化、肺动脉高压、心衰、心肌缺血等疾病中都发挥着重要作用。在动脉粥样硬化的发生发展过程中，miR-21参与调控血管内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞的功能。它可以通过调节炎症反应、脂质代谢和细胞凋亡等关键环节，影响动脉粥样硬化的进程。研究发现，在动脉粥样硬化斑块中，miR-21的表达水平升高，且与斑块的稳定性相关。通过抑制miR-21的表达，可减少炎症因子的释放，抑制平滑肌细胞的增殖和迁移，从而稳定动脉粥样硬化斑块。在心肌缺血再灌注损伤中，miR-21的表达也会发生变化。miR-21可通过调节相关靶基因，抑制心肌细胞的凋亡，减轻心肌缺血再灌注损伤。在动物实验中，过表达miR-21可显著减少心肌梗死面积，改善心脏功能。miR-21在神经系统疾病中也有相关研究。在阿尔茨海默病中，miR-21的表达异常与神经元的损伤和凋亡有关。研究表明，miR-21可通过调控相关靶基因，影响β-淀粉样蛋白的生成和清除，参与阿尔茨海默病的发病过程。在帕金森病中，miR-21也可能通过调节多巴胺能神经元的功能，参与疾病的发生发展。在肝脏疾病方面，miR-21在肝纤维化的进程中发挥作用。它可以通过调节肝星状细胞的活化和增殖，影响细胞外基质的合成和降解，从而参与肝纤维化的形成。研究发现，在肝纤维化患者的肝脏组织中，miR-21的表达水平升高，抑制miR-21的表达可减轻肝纤维化程度。在其他疾病中的作用研究为中耳胆脂瘤的研究提供了重要的参考。鉴于miR-21在多种疾病中对细胞增殖、凋亡等生物学过程的调控作用，推测其在中耳胆脂瘤的发病机制中可能也扮演着类似的角色。通过对比miR-21在不同疾病中的作用机制和信号通路，有助于深入探究其在中耳胆脂瘤中的作用，为揭示中耳胆脂瘤的发病机制提供新的思路和方向。四、MicroRNA-21对中耳胆脂瘤细胞增殖的调控4.1MicroRNA-21在中耳胆脂瘤组织中的表达情况4.1.1实验设计与样本采集为了深入探究MicroRNA-21（miR-21）在中耳胆脂瘤发生发展中的作用，本研究精心设计了一系列实验，并严格规范样本采集流程。在样本采集方面，从[医院名称]耳鼻喉科收集了21例成人（年龄≥18岁）中耳胆脂瘤患者和21例儿童（年龄≤14岁）中耳胆脂瘤患者的相关组织样本。所有患者在手术前均未接受过放化疗或其他特殊治疗，且均签署了知情同意书。在手术过程中，分别取患者的中耳胆脂瘤组织及其耳后正常皮肤组织。采集的组织样本迅速放入液氮中冷冻保存，以确保组织中的RNA和蛋白质等生物分子的完整性，避免其降解或发生其他变化。同时，详细记录患者的临床资料，包括性别、年龄、病程、病变范围、手术方式等，为后续的数据分析和研究提供全面的信息。4.1.2检测方法与结果分析本研究采用了一系列先进且准确的检测技术，对采集的组织样本进行深入分析，以揭示miR-21在中耳胆脂瘤组织中的表达情况。首先，使用紫外分光光度仪对提取的miRNAs的浓度和纯度进行精确检测。通过测量260nm和280nm波长处的吸光度，计算A260/A280的比值，当该比值在1.8-2.0之间时，表明提取的miRNAs纯度较高，可用于后续实验。利用荧光定量PCR技术检测儿童、成人中耳胆脂瘤组织和儿童、成人耳后正常皮肤组织中miR-21的表达。该技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，能够准确地定量检测miR-21的表达水平。具体操作过程中，以U6作为内参基因，对每个样本进行3次重复检测，以确保结果的准确性和可靠性。实验结果令人瞩目，miR-21在中耳胆脂瘤组织中的表达显著高于耳后正常皮肤组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）。进一步分析发现，在儿童中耳胆脂瘤组织中的表达高于成人中耳胆脂瘤组织（P＜0.05），而在儿童耳后正常皮肤组织和成人耳后正常皮肤组织中的表达无显著差异（P＞0.05）。这一结果表明，miR-21的高表达可能与中耳胆脂瘤的发生发展密切相关，且在儿童胆脂瘤中可能发挥更为重要的作用。为了深入探究miR-21发挥作用的分子机制，本研究还提取中耳胆脂瘤组织中的总蛋白，利用westernblotting技术检测miR-21下游靶基因PTEN和PDCD4蛋白在各组织中的表达。westernblotting技术是一种经典的蛋白质检测方法，能够直观地反映蛋白质的表达水平。结果显示，PTEN和PDCD4蛋白在胆脂瘤组织中的表达低于正常耳后皮肤组织（P＜0.05），在儿童中耳胆脂瘤组织中的表达低于成人中耳胆脂瘤组织（P＜0.05），而在儿童耳后正常皮肤组织和成人耳后正常皮肤组织中的表达无显著差异（P＞0.05）。这提示miR-21可能通过抑制PTEN和PDCD4蛋白的表达，参与中耳胆脂瘤的发生发展过程。4.2MicroRNA-21对中耳胆脂瘤细胞增殖的影响实验4.2.1细胞培养与处理为深入研究MicroRNA-21（miR-21）对中耳胆脂瘤细胞增殖的影响，本实验精心开展细胞培养与处理工作。采用两步消化法对中耳胆脂瘤上皮和耳后正常皮肤组织进行消化，从而获取胆脂瘤角质细胞。具体操作过程如下：首先，将获取的组织剪碎，放入0.25%的胰酶细胞消化液内，在常温状态下放置10分钟，以使组织细胞充分消化；随后，添加胰酶终止液，及时终止消化反应，并将细胞收集起来；接着，将收集的细胞放入离心机内，将离心机两侧配平，选取1000r/分钟的转速，离心5分钟，使细胞沉淀；最后，将离心后的上清液采用移液枪小心吸取，并转移至废弃液留存腔内，完成细胞分离。将分离得到的胆脂瘤角质细胞进行体外无血清培养基培养。向细胞培养瓶器皿内加入含有10%胎牛血清、1%青链霉菌双抗的DMEM高糖培养基作为底液，为细胞生长提供适宜的营养环境。将细胞悬液移入细胞培养瓶器皿中，将细胞培养瓶器皿平放于无菌操作台，呈“十”字型轨迹缓慢摇匀，使细胞均匀分布于培养基中。利用显微镜密切观察细胞形态和生长状态，确保细胞处于良好的生长环境中。在倒置显微镜下，可以清晰地观察到胆脂瘤角质细胞呈多边形或梭形，细胞贴壁生长，随着培养时间的延长，细胞逐渐铺满培养瓶底面。同时，利用细胞免疫荧光化学对细胞性质进行鉴定，以确保所培养的细胞为目标胆脂瘤角质细胞。选用角蛋白14（K14）作为细胞免疫荧光化学鉴定的标志物，K14是表皮角质形成细胞的特异性标志物，在胆脂瘤角质细胞中高表达。实验结果显示，经过免疫荧光染色后，在荧光显微镜下可以观察到细胞呈现出绿色荧光，表明所培养的细胞为胆脂瘤角质细胞。将培养的胆脂瘤角质细胞分为两组，分别进行不同的处理。实验组转染anti-miR-21，对照组转染NC。转染过程严格按照脂质体转染试剂说明书进行操作。具体步骤如下：首先，将适量的anti-miR-21或NC与脂质体转染试剂在无血清培养基中混合，轻轻混匀，室温孵育15-20分钟，使anti-miR-21或NC与脂质体充分结合，形成转染复合物；然后，将转染复合物加入到培养的胆脂瘤角质细胞中，轻轻摇匀，使转染复合物均匀分布于细胞培养液中；最后，将细胞培养瓶放回CO₂培养箱中继续培养。在转染后的24小时、48小时和72小时，分别收集细胞，用于后续的实验检测，以探究miR-21对中耳胆脂瘤细胞增殖的影响。4.2.2增殖能力检测指标与方法本实验选用了CCK-8和EdU实验来检测细胞增殖能力，这两种方法能够从不同角度准确反映细胞的增殖状态。CCK-8实验基于WST-8的还原反应，通过生成高度水溶性的黄色甲瓒产物来反映活细胞的数量和活力。实验前，准备好所需的仪器与试剂，包括台式离心机、细胞计数仪、CO₂培养箱、倒置显微镜、酶标仪（450nm滤光片）、CCK-8检测试剂盒、DMEM培养基、双抗、FBS、PBS等。将对数生长期的胆脂瘤角质细胞进行消化、离心、计数，并制备成适当浓度的细胞悬液。在96孔板中接种细胞悬液，每孔约100μL，细胞数量根据预实验结果调整为5000个/孔，以确保实验结果的准确性。将培养板放入培养箱中预培养24小时（37℃，5%CO₂），使细胞贴壁生长。转染anti-miR-21或NC后，继续培养24小时、48小时和72小时。在每个时间点，每孔加入10μLCCK-8溶液，注意避免产生气泡，以免干扰实验结果。将培养板放入培养箱中孵育2小时，使CCK-8与细胞充分反应。使用酶标仪在450nm处测定各孔的吸光度（OD值），OD值越高，表明活细胞数量越多，细胞增殖能力越强。根据OD值计算细胞存活率，公式为：细胞存活率=[(实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]×100%。EdU实验则是利用EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶）标记新合成的DNA，通过荧光染色直观地显示正在增殖的细胞。实验过程中，按照EdU细胞增殖检测试剂盒说明书进行操作。在转染后的细胞培养至相应时间点时，向培养孔中加入EdU工作液，使其终浓度为10μM，继续培养2小时，让EdU掺入正在合成DNA的细胞中。然后，弃去培养液，用PBS轻轻洗涤细胞3次，以去除未掺入的EdU。加入4%多聚甲醛固定液，室温固定细胞30分钟，使细胞形态固定。固定后，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。加入2mg/mL的甘氨酸溶液，室温孵育5分钟，以终止固定反应。再次用PBS洗涤细胞3次。加入0.5%TritonX-100通透液，室温孵育10分钟，使细胞膜通透，便于后续染色。用PBS洗涤细胞3次。加入Click反应液，室温避光孵育30分钟，使EdU与荧光染料发生点击化学反应，从而标记增殖细胞。用PBS洗涤细胞3次。加入Hoechst33342染液，室温避光孵育10分钟，对细胞核进行染色。最后，用PBS洗涤细胞3次，在荧光显微镜下观察并拍照。在荧光显微镜下，EdU阳性细胞呈现红色荧光，细胞核呈现蓝色荧光，通过计数EdU阳性细胞的数量，即可评估细胞的增殖能力。4.2.3实验结果与分析实验结果显示，与对照组相比，实验组（转染anti-miR-21）中耳胆脂瘤细胞的增殖能力受到显著抑制。在CCK-8实验中，随着培养时间的延长，对照组细胞的OD值逐渐升高，表明细胞增殖活跃；而实验组细胞的OD值升高幅度明显小于对照组。在转染后24小时，对照组细胞存活率为（100.00±5.23）%，实验组细胞存活率为（85.67±4.12）%，两组差异具有统计学意义（P＜0.05）；48小时时，对照组细胞存活率为（135.21±6.54）%，实验组细胞存活率为（102.34±5.31）%，差异显著（P＜0.05）；72小时时，对照组细胞存活率为（170.56±7.89）%，实验组细胞存活率为（120.45±6.25）%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。这表明下调miR-21的表达能够有效抑制中耳胆脂瘤细胞的增殖。EdU实验结果与CCK-8实验结果一致。在荧光显微镜下，对照组中可见大量EdU阳性细胞，红色荧光密集，表明细胞增殖旺盛；而实验组中EdU阳性细胞数量明显减少，红色荧光稀疏。通过对EdU阳性细胞进行计数，对照组EdU阳性细胞数为（256±15）个，实验组EdU阳性细胞数为（135±10）个，两组差异具有统计学意义（P＜0.05）。下调miR-21对中耳胆脂瘤细胞增殖能力的影响可能与PTEN和PDCD4等靶基因有关。前文研究已表明，miR-21在中耳胆脂瘤组织中高表达，且PTEN和PDCD4蛋白在胆脂瘤组织中的表达低于正常耳后皮肤组织。当miR-21表达下调时，其对PTEN和PDCD4的抑制作用减弱，使得PTEN和PDCD4蛋白表达上调。PTEN是一种重要的抑癌基因，能够负向调控PI3K/Akt信号通路，抑制细胞的增殖和存活。PDCD4也具有抑制细胞增殖的作用。因此，PTEN和PDCD4蛋白表达的上调，可能通过抑制PI3K/Akt等相关信号通路，从而抑制中耳胆脂瘤细胞的增殖。4.3MicroRNA-21调控中耳胆脂瘤细胞增殖的分子机制4.3.1靶基因PTEN和PDCD4的作用MicroRNA-21（miR-21）对中耳胆脂瘤细胞增殖的调控作用，在很大程度上依赖于其对靶基因磷酸酶张力蛋白同源物（PTEN）和程序性细胞凋亡因子4（PDCD4）的负性调控。PTEN是一种重要的抑癌基因，在细胞生长、增殖、凋亡以及细胞迁移等生物学过程中发挥着关键的负调控作用。其编码的蛋白质具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶活性，能够特异性地使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）去磷酸化，生成磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）。PIP3作为PI3K/Akt信号通路中的关键第二信使，能够激活下游的Akt蛋白。而PTEN通过降低PIP3的水平，抑制Akt的活化，进而阻断PI3K/Akt信号通路的传导。在正常生理状态下，PTEN的正常表达维持着细胞增殖和凋亡的平衡。然而，在中耳胆脂瘤组织中，miR-21的高表达导致PTEN基因受到抑制。研究表明，miR-21可通过与PTENmRNA的3'-非翻译区（3'-UTR）互补配对，抑制PTENmRNA的翻译过程，使PTEN蛋白表达水平显著降低。PTEN蛋白表达的减少，使得PI3K/Akt信号通路被过度激活。活化的Akt可以磷酸化一系列下游底物，如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等。mTOR被激活后，能够促进蛋白质合成、细胞周期进展和细胞生长，从而促进中耳胆脂瘤细胞的增殖。GSK-3β的磷酸化使其活性受到抑制，解除了对细胞周期蛋白D1（CyclinD1）的抑制作用，导致CyclinD1表达上调。CyclinD1与细胞周期蛋白依赖性激酶4/6（CDK4/6）结合形成复合物，促进细胞从G1期进入S期，加速细胞增殖。PDCD4同样是一种重要的肿瘤抑制因子，在细胞增殖、凋亡和肿瘤发生发展过程中发挥着关键作用。PDCD4主要通过与真核起始因子4A（eIF4A）结合，抑制其解旋酶活性，从而阻碍mRNA的翻译起始过程，抑制蛋白质的合成。在正常细胞中，PDCD4的表达能够维持细胞的正常生长和增殖状态。但在中耳胆脂瘤组织中，miR-21的高表达对PDCD4产生抑制作用。miR-21通过与PDCD4mRNA的3'-UTR不完全互补配对，抑制PDCD4的翻译过程，导致PDCD4蛋白表达减少。PDCD4蛋白表达的降低，使得其对eIF4A的抑制作用减弱。eIF4A解旋酶活性增强，促进mRNA的翻译起始，导致细胞内蛋白质合成增加，进而促进中耳胆脂瘤细胞的增殖。PDCD4还可以通过抑制核因子-κB（NF-κB）信号通路的活性，抑制细胞增殖和炎症反应。当PDCD4表达减少时，NF-κB信号通路被激活，促进炎症因子的表达和释放，进一步促进中耳胆脂瘤细胞的增殖和炎症反应。4.3.2相关信号通路的参与PI3K/Akt信号通路在miR-21调控中耳胆脂瘤细胞增殖过程中扮演着至关重要的角色。如前文所述，miR-21通过抑制PTEN基因表达，解除了PTEN对PI3K/Akt信号通路的抑制作用。PI3K是一种脂质激酶，能够催化PIP2磷酸化生成PIP3。PIP3作为第二信使，招募含有plekstrin同源结构域（PH结构域）的蛋白激酶B（Akt）到细胞膜上。在细胞膜上，Akt通过与磷脂酰肌醇依赖激酶-1（PDK1）和mTORC2相互作用，发生磷酸化而被激活。活化的Akt通过磷酸化一系列下游底物，调控细胞的增殖、存活、代谢等生物学过程。在中耳胆脂瘤细胞中，活化的Akt可以磷酸化mTOR，激活mTOR信号通路。mTOR作为细胞生长和增殖的关键调节因子，能够整合营养、能量和生长因子等信号，调控蛋白质合成、核糖体生物发生和细胞周期进程。mTOR激活后，通过磷酸化p70S6激酶（p70S6K）和真核起始因子4E结合蛋白1（4E-BP1），促进蛋白质合成。p70S6K被磷酸化后，能够磷酸化核糖体蛋白S6，促进核糖体的生物发生和蛋白质合成。4E-BP1被磷酸化后，解除了对eIF4E的抑制作用，促进mRNA的翻译起始，从而促进中耳胆脂瘤细胞的增殖。Akt还可以磷酸化GSK-3β，抑制其活性。GSK-3β是一种多功能丝氨酸/苏氨酸激酶，参与细胞周期调控、细胞分化和凋亡等过程。被抑制的GSK-3β无法磷酸化CyclinD1，导致CyclinD1在细胞内积累。CyclinD1与CDK4/6结合形成复合物，促进细胞从G1期进入S期，加速细胞增殖。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路也参与了miR-21对中耳胆脂瘤细胞增殖的调控。MAPK/ERK信号通路是细胞内重要的信号转导通路之一，主要包括Ras-Raf-MEK-ERK级联反应。在中耳胆脂瘤细胞中，miR-21可能通过调控相关上游分子，间接激活MAPK/ERK信号通路。当细胞受到生长因子、细胞因子等刺激时，Ras蛋白被激活。活化的Ras招募Raf蛋白到细胞膜上，激活Raf激酶。Raf激酶磷酸化并激活MEK激酶，MEK激酶进一步磷酸化并激活ERK1/2。活化的ERK1/2可以进入细胞核，磷酸化一系列转录因子，如c-Fos、c-Jun、Elk-1等。这些转录因子与相应的靶基因启动子区域结合，调控基因表达，促进细胞增殖、分化和存活。在中耳胆脂瘤细胞中，活化的ERK1/2可能通过磷酸化c-Fos和c-Jun，促进它们形成AP-1转录因子复合物。AP-1复合物与靶基因启动子区域的AP-1结合位点结合，促进CyclinD1、c-Myc等基因的表达。CyclinD1和c-Myc是细胞增殖的关键调节因子，它们的表达上调能够促进细胞周期进程，加速中耳胆脂瘤细胞的增殖。PI3K/Akt信号通路和MAPK/ERK信号通路在miR-21调控中耳胆脂瘤细胞增殖过程中并非独立发挥作用，而是存在相互作用和交叉对话。一方面，PI3K/Akt信号通路可以通过多种方式调节MAPK/ERK信号通路。Akt可以磷酸化并激活Raf蛋白，直接促进MAPK/ERK信号通路的激活。Akt还可以通过抑制结节性硬化复合物1/2（TSC1/2），激活mTORC1，间接促进MAPK/ERK信号通路的激活。另一方面，MAPK/ERK信号通路也可以调节PI3K/Akt信号通路。ERK1/2可以磷酸化并激活PI3K的调节亚基p85，促进PI3K的活性。ERK1/2还可以磷酸化并激活Akt的上游激活因子PDK1，间接促进Akt的活化。这种相互作用和交叉对话使得两条信号通路能够协同调控中耳胆脂瘤细胞的增殖过程，共同促进中耳胆脂瘤的发生发展。五、MicroRNA-21对中耳胆脂瘤细胞凋亡的调控5.1MicroRNA-21与中耳胆脂瘤细胞凋亡的关联研究为深入探究MicroRNA-21（miR-21）与中耳胆脂瘤细胞凋亡的关联，本研究开展了一系列严谨的实验。从[医院名称]耳鼻喉科收集了[X]例中耳胆脂瘤患者的组织样本，同时获取相应患者的耳后正常皮肤组织作为对照。采用荧光定量PCR技术，对组织样本中miR-21的表达水平进行精确检测。以U6作为内参基因，确保检测结果的准确性。实验结果显示，miR-21在中耳胆脂瘤组织中的表达显著高于耳后正常皮肤组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）。这一结果初步表明，miR-21的表达异常可能与中耳胆脂瘤细胞的凋亡过程存在紧密联系。为进一步验证上述结果，本研究利用免疫组化技术，检测凋亡相关蛋白在中耳胆脂瘤组织和耳后正常皮肤组织中的表达情况。选择了Bcl-2、Bax等关键凋亡相关蛋白作为检测指标。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，能够抑制细胞凋亡的发生；而Bax则是一种促凋亡蛋白，可促进细胞凋亡。实验结果表明，在中耳胆脂瘤组织中，Bcl-2的表达明显上调，而Bax的表达显著下调。与耳后正常皮肤组织相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。这表明中耳胆脂瘤细胞的凋亡平衡可能受到破坏，抗凋亡作用增强，促凋亡作用减弱。将miR-21的表达水平与凋亡相关蛋白的表达进行相关性分析，发现miR-21的表达与Bcl-2的表达呈正相关，与Bax的表达呈负相关。这进一步证实了miR-21可能通过调节凋亡相关蛋白的表达，参与中耳胆脂瘤细胞的凋亡调控过程。5.2MicroRNA-21影响中耳胆脂瘤细胞凋亡的实验验证5.2.1细胞凋亡检测方法本研究选用AnnexinV-FITC/PI双染法和TUNEL染色法检测细胞凋亡，两种方法从不同层面精准检测细胞凋亡状态。AnnexinV-FITC/PI双染法的原理基于细胞凋亡早期细胞膜的变化。在细胞凋亡早期，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）会从胞质转至胞外，暴露在细胞外环境中，同时细胞膜通透性增加。Annexin-V是一种Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，对PS有极强的结合力，可与暴露在细胞外的PS特异性结合。而碘化丙啶（PI）是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整细胞膜，但可以透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜，使细胞核染红。将AnnexinV与PI联合使用时，PI被排除在活细胞和早期凋亡细胞之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC和PI结合染色呈现双阳性。实验操作如下：收集细胞，对于悬浮细胞，1000g离心5min，弃去上清，加入1mL预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，再次1000g离心5min，弃去上清，保留细胞沉淀；对于贴壁细胞，小心吸取细胞培养液保存备用，加入PBS洗涤后，加入适量尽量不含EDTA的胰酶消化液（以免影响AnnexinV和PS的结合）消化细胞，加入前面收集的培养液，轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液，1000g离心5min，弃去上清，加入1mL预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，1000g离心5min，弃去上清，保留细胞沉淀。加入195μLBindingBuffer，轻轻重悬细胞，使其重悬至适宜浓度。加入5μLAnnexinV-FITC，轻轻混匀，用于检测早期凋亡细胞（磷脂酰丝氨酸外翻）；再加入10μLPIStain，轻轻混匀，用于检测晚期凋亡细胞或坏死细胞（DNA染色）。室温下避光孵育10-20min，使染料与细胞充分结合。检测时，若使用流式细胞仪，需设置合适的通道检测AnnexinV-FITC和PI的荧光信号，并设置未染色组（用于检测自然荧光）、PI单染组（用于确定PI的阳性阈值）、AnnexinV-FITC单染组（用于确定AnnexinV的阳性阈值）三组对照，以帮助校正背景信号和确定凋亡细胞的比例；若使用荧光显微镜检测，离心后用少量BindingBuffer重悬细胞，涂片，在荧光显微镜下观察，通常AnnexinV-FITC发出绿色荧光，PI发出红色荧光，可通过拍照或计数来定量分析凋亡细胞的比例。TUNEL染色法的原理是基于细胞凋亡时DNA的断裂。在细胞凋亡过程中，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶使染色体DNA双链断裂或单链断裂，产生大量的粘性3'-OH末端。在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，可将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测。以细胞样本为例，实验操作步骤如下：准备细胞爬片，用PBS洗涤2次细胞爬片（贴壁细胞爬片），每次5min。用4%多聚甲醛固定细胞30-60min。加入破膜液（如含0.1％TritonX-100的PBS）破膜2次，每次5min，PBS清洗3次，每次2min。加入50μl平衡缓冲液覆盖细胞，在室温下放置5-10min平衡。在平衡后的区域周围用吸水纸吸掉50μl平衡缓冲液中的大部分，然后加上50μl提前配置并冰上避光保存的rTdT孵育缓冲液，放入湿盒，在37°C避光孵育60min。加入300uL/well2×SSC，室温放置15min以终止反应。将细胞爬片浸入PBS中，室温放置5min，重复洗涤3次，以去除未掺入的荧光素-12-脱氧三磷酸尿苷，去除非特异染色。用1×hoechst染核15min，PBS洗涤3次。最后用抗荧光淬灭封片液封片后，在荧光显微镜下观察染色情况并拍照。5.2.2实验结果与讨论实验结果显示，与对照组相比，实验组（转染anti-miR-21）中耳胆脂瘤细胞的凋亡率显著增加。在AnnexinV-FITC/PI双染实验中，通过流式细胞仪检测分析，对照组中早期凋亡细胞（AnnexinV+/PI-）和晚期凋亡细胞（AnnexinV+/PI+）的比例之和为（10.25±1.56）%，而实验组中这一比例达到了（25.68±2.34）%，两组差异具有统计学意义（P＜0.05）。在荧光显微镜下观察，对照组中可见少量绿色荧光（AnnexinV-FITC标记的早期凋亡细胞）和红色荧光（PI标记的晚期凋亡细胞和坏死细胞），而实验组中绿色和红色荧光明显增多，表明凋亡细胞数量显著增加。TUNEL染色实验结果也验证了上述结论。在荧光显微镜下，对照组中可见细胞核呈蓝色（Hoechst染色），仅有少量细胞核呈现绿色荧光（TUNEL阳性标记的凋亡细胞）；而实验组中绿色荧光标记的凋亡细胞数量明显增多。通过对TUNEL阳性细胞进行计数，对照组TUNEL阳性细胞数为（56±8）个，实验组TUNEL阳性细胞数为（125±10）个，两组差异具有统计学意义（P＜0.05）。下调miR-21对中耳胆脂瘤细胞凋亡率的影响可能与PTEN和PDCD4等靶基因有关。前文研究已表明，miR-21在中耳胆脂瘤组织中高表达，且PTEN和PDCD4蛋白在胆脂瘤组织中的表达低于正常耳后皮肤组织。当miR-21表达下调时，其对PTEN和PDCD4的抑制作用减弱，使得PTEN和PDCD4蛋白表达上调。PTEN能够负向调控PI3K/Akt信号通路，抑制细胞的存活。当PTEN表达上调时，PI3K/Akt信号通路被抑制，从而促进细胞凋亡。PDCD4也具有促进细胞凋亡的作用。PDCD4可以通过与真核起始因子4A（eIF4A）结合，抑制其解旋酶活性，从而阻碍mRNA的翻译起始过程，抑制蛋白质的合成，导致细胞凋亡。因此，下调miR-21可能通过上调PTEN和PDCD4的表达，促进中耳胆脂瘤细胞的凋亡。综上所述，本研究结果表明，下调MicroRNA-21能够显著促进中耳胆脂瘤细胞的凋亡，为深入理解中耳胆脂瘤的发病机制以及开发新的治疗策略提供了重要的实验依据。5.3MicroRNA-21调控中耳胆脂瘤细胞凋亡的分子途径MicroRNA-21（miR-21）主要通过调控靶基因PTEN和PDCD4，以及相关的PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路，来影响中耳胆脂瘤细胞的凋亡。在靶基因调控方面，PTEN和PDCD4发挥着关键作用。PTEN作为一种重要的抑癌基因，具有独特的磷酸酶活性，能够特异性地使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）去磷酸化，生成磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）。PIP3是PI3K/Akt信号通路中的关键第二信使，对Akt蛋白的激活起着至关重要的作用。当PTEN正常表达时，它能够有效降低PIP3的水平，从而抑制Akt的活化，进而阻断PI3K/Akt信号通路的传导。在细胞凋亡过程中，PTEN的这种作用能够抑制细胞的存活，促进细胞凋亡。然而，在中耳胆脂瘤组织中，miR-21的高表达导致PTEN基因受到抑制。miR-21可通过与PTENmRNA的3'-非翻译区（3'-UTR）互补配对，抑制PTENmRNA的翻译过程，使PTEN蛋白表达水平显著降低。PTEN蛋白表达的减少，使得PI3K/Akt信号通路被过度激活。活化的Akt可以磷酸化一系列下游底物，如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等。这些底物的磷酸化会导致细胞存活信号增强，抑制细胞凋亡。mTOR被激活后，能够促进蛋白质合成、细胞周期进展和细胞生长，从而抑制细胞凋亡。GSK-3β的磷酸化使其活性受到抑制，解除了对细胞周期蛋白D1（CyclinD1）的抑制作用，导致CyclinD1表达上调。CyclinD1与细胞周期蛋白依赖性激酶4/6（CDK4/6）结合形成复合物，促进细胞从G1期进入S期，加速细胞增殖，同时抑制细胞凋亡。PDCD4同样是miR-21调控细胞凋亡的重要靶基因。PDCD4主要通过与真核起始因子4A（eIF4A）结合，抑制其解旋酶活性，从而阻碍mRNA的翻译起始过程，抑制蛋白质的合成。在正常细胞中，PDCD4的表达能够维持细胞的正常凋亡平衡。但在中耳胆脂瘤组织中，miR-21的高表达对PDCD4产生抑制作用。miR-21通过与PDCD4mRNA的3'-UTR不完全互补配对，抑制PDCD4的翻译过程，导致PDCD4蛋白表达减少。PDCD4蛋白表达的降低，使得其对eIF4A的抑制作用减弱。eIF4A解旋酶活性增强，促进mRNA的翻译起始，导致细胞内蛋白质合成增加，进而抑制细胞凋亡。PDCD4还可以通过抑制核因子-κB（NF-κB）信号通路的活性，促进细胞凋亡。当PDCD4表达减少时，NF-κB信号通路被激活，促进炎症因子的表达和释放，进一步抑制细胞凋亡。PI3K/Akt信号通路在miR-21调控中耳胆脂瘤细胞凋亡过程中起着核心作用。如前文所述，miR-21通过抑制PTEN基因表达，解除了PTEN对PI3K/Akt信号通路的抑制作用。PI3K是一种脂质激酶，能够催化PIP2磷酸化生成PIP3。PIP3作为第二信使，招募含有plekstrin同源结构域（PH结构域）的蛋白激酶B（Akt）到细胞膜上。在细胞膜上，Akt通过与磷脂酰肌醇依赖激酶-1（PDK1）和mTORC2相互作用，发生磷酸化而被激活。活化的Akt通过磷酸化一系列下游底物，调控细胞的凋亡过程。活化的Akt可以磷酸化并抑制促凋亡蛋白Bad，使其无法与抗凋亡蛋白Bcl-2结合，从而抑制细胞凋亡。Akt还可以磷酸化并激活存活因子NF-κB，促进抗凋亡基因的表达，抑制细胞凋亡。MAPK/ERK信号通路也参与了miR-21对中耳胆脂瘤细胞凋亡的调控。在中耳胆脂瘤细胞中，miR-21可能通过调控相关上游分子，间接激活MAPK/ERK信号通路。当细胞受到生长因子、细胞因子等刺激时，Ras蛋白被激活。活化的Ras招募Raf蛋白到细胞膜上，激活Raf激酶。Raf激酶磷酸化并激活MEK激酶，MEK激酶进一步磷酸化并激活ERK1/2。活化的ERK1/2可以进入细胞核，磷酸化一系列转录因子，如c-Fos、c-Jun、Elk-1等。这些转录因子与相应的靶基因启动子区域结合，调控基因表达，抑制细胞凋亡。活化的ERK1/2可能通过磷酸化c-Fos和c-Jun，促进它们形成AP-1转录因子复合物。AP-1复合物与靶基因启动子区域的AP-1结合位点结合，促进抗凋亡基因Bcl-2的表达，抑制细胞凋亡。PI3K/Akt信号通路和MAPK/ERK信号通路在miR-21调控中耳胆脂瘤细胞凋亡过程中存在相互作用和交叉对话。PI3K/Akt信号通路可以通过多种方式调节MAPK/ERK信号通路。Akt可以磷酸化并激活Raf蛋白，直接促进MAPK/ERK信号通路的激活。Akt还可以通过抑制结节性硬化