情境1淀粉酶的发酵生产任务1淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定

情境1淀粉酶的发酵生产任务1：淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定

淀粉酶属于水解酶类，是催化淀粉（包括糖原，糊精）中糖苷键水解的一类酶的统称。它是研究较多，生产最早，产量最大和应用最广泛的一种酶。α-淀粉酶葡萄糖淀粉酶β-淀粉酶异淀粉酶从非还原性末端以葡萄糖为单位顺次分解淀粉，糖原类物质的α-1,4糖苷键霉菌，细菌，酵母等分解支链淀粉，糖原类物质的α-1,6糖苷键植物，酵母，细菌淀粉酶

不规则地分解淀粉，糖原类物质的α-1,

4糖苷键,产物的末端葡萄糖残基C1碳原子为α-构型，故称α-淀粉酶。

唾液，胰脏，麦芽，霉菌，细菌

从非还原性末端以麦芽糖为单位顺次分解淀粉，糖原类物质的α-1,4糖苷键甘薯，大豆，大麦，麦芽，细菌什么是淀粉酶淀粉酶属于()类氧化还原酶水解酶异构酶裂合酶ABCD提交单选题α-淀粉酶的工厂生产α-淀粉酶能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。目前，国内外生产α-淀粉酶所采用的菌种主要有细菌和霉菌两大类，典型的为芽孢杆菌和米曲霉。米曲霉常用固态曲法培养，其产品主要用作消化剂，产量较小，芽孢杆菌则主要采用液体深层通风培养法，能大规模地生产α-淀粉酶。α-淀粉酶能水解淀粉产生的产物包括（），是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。糊精麦芽糖低聚糖葡萄糖ABCD提交多选题α-淀粉酶的用途深层发酵法生产α-淀粉酶：我国目前主要用深层发酵法生产α-淀粉酶；所用菌种主要为枯草杆菌BF7658-1，该菌种呈短杆状，革兰氏阳性，两端钝圆，在肉汁表面可生成菌膜，在培养基上菌落成乳白色，表面光滑、湿润、略有光泽，用碘液检测，菌落周围呈透明圈a-淀粉酶液体深层发酵工艺流程包装枯草杆菌BF7658斜面菌种芽孢悬浮液种子罐发酵罐补料无菌空气热处理盐析压滤干燥粉碎混粉粗滤喷雾干燥填充料我国目前主要用（）发酵法生产α-淀粉酶；所用菌种主要为（）固态发酵法，米曲霉液体深层发酵法，枯草杆菌BF7658-1AB提交单选题淀粉酶的发酵生产，首先要有高产淀粉酶的菌种，菌种从何而来？一方面是向有关生产单位或科研机构索取或购买，另一方面是自己选育。本学习情境中，我们将从淀粉酶产生菌的筛选开始学习，通过诱变等手段对菌种进行改良，并对培养基和培养条件进行优化，最后对发酵所产淀粉酶进行提取，得到淀粉酶的粗品。情境描述本学习情境中我们将完成下列任务：任务1：淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定任务2：淀粉酶产生菌的改良任务3：淀粉酶产生菌的发酵条件优化任务4：淀粉酶的后提取任务1：淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定任务目标一、常见工业微生物菌种（一）发酵工业菌种要求

①培养基原料来源广、廉价；②培养条件易控制；③发酵周期短；④菌株高产；⑤抗病毒（噬菌体）能力强；⑥菌株性状稳定，不易变异退化；⑦菌体本身不能是病原菌；（二）发酵工业常用的菌种细菌类放线菌酵母菌丝状真菌

1、常用的细菌

大肠杆菌应用：对谷氨酸定量分析，生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸。

乳酸杆菌应用：乳酸、干酪、奶子酒、发面、泡菜、酸奶等的制作

枯草芽孢杆菌应用：生产淀粉酶2、酵母菌种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母红酵母、面包酵母

应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取蛋白质、生产脂肪啤酒酵母红酵母面包酵母假丝酵母3、霉菌曲霉属应用：生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶应用：酱油、酱类（淀粉酶）

米曲霉应用：产糖化酶和蛋白酶、主要用于酿酒制曲和酱油制曲应用：生产甲义丁二酸

毛霉应用：可以产生蛋白酶，我国多用于豆腐乳、豆豉等的制作根霉种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉应用：酿酒青霉菌应用：生产青霉素、葡萄糖氧化酶4、放线菌

种类：龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红霉素链霉菌应用：各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、红霉素在液体浸没培养中由于搅拌器的剪切应力作用，常常形成短的分支旺盛的菌丝体，或呈分散生长，或呈菌丝团状生长。放线菌的最大经济价值在于能产生多种抗生素(antibiotic)。从微生物中发现的抗生素，有60％以上是放线菌产生的，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。常用的放线菌主要来自以下几个属：链霉菌属、小单孢菌属和诺卡菌属等。⒌担子菌⒍藻类螺旋藻灵芝发酵工业常用的菌种包括（）细菌霉菌放线菌酵母菌ABCD提交多选题二、工业微生物菌种的分离筛选工业发酵的生产水平有三个决定因素：生产菌种的性能发酵、提纯的工艺条件生产设备生产菌株来源

向菌种保藏机构索取有的菌株，从中筛选所需菌株。

由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。

从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。

设计方案→采样→增殖培养*→平板分离→筛选(初筛、复筛)→单株纯种分离→性能考察(生产性能试验、毒性试验、菌种鉴定）从自然界中分离筛选菌种的一般步骤采样

从自然界种采集含目的菌的样品1. 环境条件对土样本中微生物分布的影响（1）营养环境①高糖环境（加工蜜饯、糖果、蜂蜜的环境）土壤中：耐渗透压酵母，柠檬酸产生菌，氨基酸产生菌；②富含淀粉环境污泥、水沟旁土壤中：淀粉酶产生菌；③森林中腐叶烂草下土壤：纤维素酶产生菌；④含蛋白质（蚕丝、豆饼、生皮晒厂）土壤中：蛋白酶产生菌；⑤油田土：石油分解菌；（2）水分①离地表5-25cm土样②含水过多、过少都不理想（3）温度：采样以秋季为好（4）通风（5）酸碱度：

细菌、放线菌：中性或偏碱；霉菌、酵母：偏酸2 .采样方法（1）去除表层土（2）取5-25cm土样10-25克，装入无菌牛皮纸袋或塑料袋中3. 注意记录：时间，地点，环境情况等样品袋应封好口，防止水分失去土样应在分离前破碎尽快分离二、增殖培养（富集培养）适用：样品中目的菌数量不够多时目的：提高样品中目的菌的数量和比例原理：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌得以繁殖和/或非目的菌的生长受到抑制方法：（1）控制营养成分

①纤维素为唯一碳源，可增殖分解纤维素的菌②可溶性淀粉为唯一碳源，可增殖产淀粉酶的菌种③酒精废水，可以增殖废水利用菌*多种微生物所利用的碳源、氮源不能作控制因素（2）控制培养基pH

细菌、放线菌：中性偏碱，真菌：偏酸

但非目的菌的生长不能被完全抑制（3）控制培养温度30℃左右培养，可培殖嗜温微生物50~60℃培养，可培殖嗜热微生物，筛选耐热菌株（4）热处理——增殖芽孢细菌

样品悬浮液经80℃、10分钟处理，杀死营养体，再添加营养培养后可增殖产芽孢细菌（5）添加抑制剂10%酚数滴：抑制细菌霉菌生长，增殖放线菌抗生素：抑制细菌放线菌，增殖酵母、霉菌多粘菌素B：抑制G-细菌青霉素：抑制G+细菌制毒菌素：抑制真菌放线菌酮：抑制真菌三、纯种分离目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得纯培养.1 纯种分离的一般方法（1）稀释涂布分离法倾注平板或涂布平板（2）划线分离法稀释涂布分离划线分离2、平皿反应快速检出法——定性或半定量1）、透明圈法

分离水解酶产生菌时采用较多，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；

在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊；

能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。比如分离淀粉酶产生菌：淀粉作为碳源例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生一透明圈。

分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法初筛

在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据，因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之间并不完全成正比。

但作为初筛的手段是有意义的2）、变色圈法在底物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；如筛选谷氨酸产生菌时，加入溴百里酚蓝，pH在6.2以下时为黄色，pH7.6以上为蓝色。用刚果红染色法鉴定筛选降解纤维素的菌株

羧甲基纤维素钠作培养物分离解脂微生物甘油三丁酸酯为底物罗丹明B为指示剂荧光圈3）、生长圈法

通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈

工具菌（指示菌）是一些相对应的营养缺陷型菌株如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌

只要是筛选微生物所需营养物的产生菌时，都可采用生长圈法，工具菌用相应的营养缺陷型菌株，由于得到所需营养，凡是目的微生物周围便会出现混浊的生长圈。4）、抑菌圈法

常用于抗生素产生菌的分离筛选

工具菌采用抗生素的敏感菌若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌

方法目的菌分离：稀释分离法，培养长出菌落代谢物积累：用打孔器（6CM）将菌落连同周围琼脂培养基一起取下，放一无菌空培养皿内，保湿培养4-5天，使新产生抗生素积累于小琼脂块中测定：取107工具菌涂布于琼脂培养基，将小琼脂块放于上面培养过夜，抑菌圈的出现，说明琼脂块中有抗生